- •Законы Менделя.
- •Полигены (предложены Мазером). Полигенное наследование.
- •Гены-модификаторы
- •Хромосомная теория наследственности. (Морган и др.)
- •Генетический анализ неполного сцепления.
- •Карты хромосом.
- •Принципы построения цитологических карт:
- •Картирование генов у человека.
- •Метод отношения правдоподобия
- •Получение гибридных соматических клеток.
- •Картирование генов с использованием транслокаций и делеций.
- •Метод днк-зондов.
- •N мутант n
- •Молекулярные основы наследственности.
- •Структурные особенности строения и упаковки хромосом.
- •Приготовление хромосомных препаратов.
- •Денверовская классификация:
- •Полимеразная цепная реакция (пцр).
- •1983 Г. Карри Муллис метод анализа геномной днк.
- •Блот-гибридизация по Саузерленду (гибридизация in situ).
- •Плазмиды.
- •Геномная и тканеспецифичная днк. Библиотеки генов, их скрининг.
- •Секвенирование последовательностей днк.
- •Механизмы, нарушающие равновесие генов в популяции
- •Дрейф генов.
- •Генетика пола.
- •Мобильные элементы генома (мгэ).
- •Транспозоны млекопитающих.
- •Функциональное значение мгэ.
- •Изменчивость наследственного материала.
- •Мутационная теория. Классификация мутаций.
- •Закон гомологических рядов Вавилова.
- •Генеративные и соматические мутации.
- •Индуцированные мутации.
- •Хромосомные перестройки.
- •Полиплоидия.
- •Эксцезионная репарация. Темновая репарация и внеплановый синтез днк.
Приготовление хромосомных препаратов.
У человека берут небольшое количество клеток доступных и пригодных для цитогенетических исследований (клетки кожи – фибробласты, клетки костного мозга). Клетки костного мозга интенсивно делятся, но забор их затруднен. Фибробласты достаточно хорошо делятся в культуре, но культивирование занимает ≈ 18 – 20 дней.
В конце 50-х годов было обнаружено, что вытяжка из конских бобов способна стимулировать к делению клетки периферической крови. Действующее вещество вытяжки – фитогемагглютинин (ФГА).
Цельную периферическую кровь или выделенную лейкоцитарную массу помещают в питательную среду (199, RPM I, Игла) + ФГА, через 48 часов / 72 часа добавляют колхицин и через 2 часа клетки можно фиксировать. Перед фиксацией проводят гипотоническую обработку 0,56% раствором KCl. Проводится фиксация жидкостью Корнуа и рутинное окрашивание (азур – эозин или по Гимзе) или дифференциальное окрашивание.
В случае рутинного окрашивания все хромосомы окрашены одинаково и классификация их возможна только по группам (1961 г. в Денвере). В основу денверовской классификации легли величина хромосом и положение центромеры.
Денверовская классификация:
А – крупные метацетрические (1-3): крупные хромосомы с почти медианными центромерами в хромосомах 1 и 3, субмедианной цетромерой – 2. Эти 3 хромосомы хорошо отличаются друг от друга размерами и положением центромеры. Хромосома 1 содержит вторичную перетяжку в субцентромерном районе одного из плеч (более длинного).
В – крупные субметацентрические хромосомы с субтерминальными центромерами (4-5): хромосомы этих пар ни морфологически, ни размерами не различаются между собой. В редких случаях в хромосомах этой группы обнаруживается вторичная перетяжка в длинном плече вблизи центромеры.
С – средние субметацентрические (6-12,Х): хромосомы средних размеров с субмедианными центромерами, Х-хромосома сходна с самыми длинными хромосомами этой группы 6,7, от которых её трудно отличить. 6,7,8,11 и Х – более метацентричны; 9,10,12 – более субметацентричны. Хромосома 6 имеет вторичную перетяжку в середине короткого плеча. Хромосомы 8 и 9 содержат вторичную перетяжку в длинном плече вблизи центромеры.
D – крупные акроцентрические (13-15): хромосомы средних размеров с почти терминальными центромерами; все 3 пары являются потенциально спутничными, но не в каждой клетке и не у всех индивидуумов спутники обнаруживаются на всех хромосомах. Чаще всего спутники обнаруживаются на одной или двух парах. Между собой 3 пары хромосом морфологически неразличимы. Длинное плечо одной из этих хромосом имеет вторичную перетяжку вблизи центромеры.
Е – маленькие субметацентрические (16-18): довольно короткие хромосомы с почти медианным (16), субмедианным (17) и субтерминальным (18) центромерами. Хромосомы 16, 17 содержат в длинном плече вблизи центромеры вторичную перетяжку.
F – маленькие метацентрические (19-20): короткие хромосомы с почти медианными центромерами. Между собой неразличимы.
G – маленькие акроцентрические (21-22): очень короткие акроцентрические хромосомы. Обе пары хромосом потенциально спутничные, однако обычно лишь 2 хромосомы имеют на коротком плече хорошо выраженные спутники. На других хромосомах спутник выявляется реже. Между собой неразличимы.
У – хромосома: маленькая акроцентрическая хромосома; сходна по размерам и форме с 21 и 22 хромосомами, но не имеет спутников, отличается большей пикнотичностью и сближенными хроматидами длинного плеча, в середине длинного плеча имеет вторичную перетяжку.
Молекулярная биология.
Структура и методы анализа ДНК.
ДНК содержит информацию, необходимую для синтеза белка из АК. ДНК находится в клетках эукариот и прокариот.
ДНК – молекула, состоящая из 4 нуклеотидов: пуринов (А, Г) и пиримидинов (Ц, Т), которые соединяются в полинуклеотидную цепь, в которой чередуются остаток сахара (дезоксирибоза) и фосфат. Последовательность нуклеотидов ДНК (пар оснований) составляет информационную емкость молекулы, определяя порядок синтеза и АК последовательность белков в соответствии с 3-х буквенным (триплетным, универсальным) генетическим кодом.
ДНК представляет единственный тип молекул, способных к самовоспроизводству (репликации), что и обеспечивает преемственность генетической информации в ряду поколений. Размеры ДНК могут меняться в гигантских пределах: от нескольких нуклеотидов до млрд. п.о.
В качестве единиц измерения размеров ДНК используют кило- и мегабары??????????????
Последовательности из 1000 и 1000000 п.о. ДНК может существовать как в виде однонитевых, так и в виде двунитевых молекул:
Двуцепочечные молекулы образуются в результате комплементарно соединенных между собой Г и Ц, А и Т. Водородные связи между парами нуклеотидов достаточно не прочны, поэтому цепи ДНК легко диссоциировать или разделить и также легко ассоциировать (соединить при изменении температуры или солевой концентрации). При каждом цикле ассоциации и диссоциации (отжиг – плавление) будет точно воспроизводиться двунитевая структура – дуплекс, устойчивость которой определяется соответствием нуклеотидных пар. Наиболее устойчивы структуры представленные полностью комплиментарными нитями ДНК. Процесс образования дуплексов – гибридизация.
Способность к комплементарному взаимодействию оснований – одно из самых важных свойств ДНК, которое определяет возможность её саморепликации. Это свойство широко используют в молекулярной биологии для поиска и идентификации нужных последовательностей в молекуле ДНК с помощью специфических зондов – небольшие меченые фрагменты ДНК.
Нити ДНК:
кодирующая (смысловая)
комплементарная (антисмысловая)
Декодирование информации, заключенной в молекуле ДНК (транскрипция) осуществляется за счёт избирательного синтеза РНК, комплементарных определенным участкам ДНК, так называемых РНК – транскриптов.
Т.о., зная нуклеотидную последовательность кодирующего участка ДНК, можно однозначно прогнозировать АК последовательность, соответствующую полинуклеотидному фрагменту, тогда как одна и та же АК последовательность может кодироваться различным образом, при этом число возможных вариантов кодирующей ДНК резко возрастает с увеличением длины полипептида.
Схема реализации потока информации:
ДНК → РНК → белок составляет основу молекулярной биологии.
Выделение ДНК, её синтез и рестрикция
ДНК может быть изолирована или выделена из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра.
Этапы выделения ДНК:
быстрый лизис клеток
удаление с помощью центрифугирования клеточных органелл и мембран
ферментативное разрушение белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и хлороформа
концентрирование молекул ДНК путём преципитации в этаноле
Из 1 грамма ткани или 109 клеток → 2 мг ДНК.
У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов или лимфоцитов. Для этого собирают 5 – 20 мл венозной крови, затем выделяют клетки специальным методом и разрушают клетки и ядерные мембраны, добавляя буферные растворы, которые содержат денатурирующие агенты. После разрушение мембран клеток добавляют протеиназу К/Е, затем проводят фенол – хлороформную экстракцию для разрушения белков, затем ДНК осаждают в этаноле (75о), высушивают ДНК в течение суток и растворяют в специальном буферном растворе и в дистиллированной воде.
Оценку качества полученной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности в области белкового и нуклеинового спектра поглощения. В чистых образцах соотношении Е (260) / Е (280) > 1,8.
В противном случае процедуру очистки следует повторить, т.к. белки должны быть удалены. В процессе сложного и многообразного функционирования участки хромосом и ДНК претерпевают разнообразные, регулируемые и обратимые изменения. Эти модификации осуществляются с помощью ферментов (ДНК – полимераза, рестриктаза).
Ферменты, осуществляющие синтез ДНК, называются ДНК – полимеразы. И в бактериальных клетках и клетках эукариот содержатся 3 различные формы ДНК – полимераз. Все они обладают синтезирующей активностью и способны удлинять цепь ДНК в направлении 5/ - 3/, последовательно присоединяя по 1 нуклеотиду к 3/ - ОН концу, причем точность синтеза определяется комплементарностью. Т.о. для работы фермента ДНК – полимераза необходима однонитевая матричная ДНК с 3/ - концом. Кроме того в середине ДНК должны присутствовать 4 типа dNTP (дезоксинуклеотид-3-фосфаты), сахар и 3 остатка фосфорной кислоты.
В клетках эукариот репликацию осуществляет ДНК – полимераза α, которая обладает различной активностью, в том числе и экзонуклеазной активностью в направлении 3/ - 5/. Это позволяет исправлять (репарировать те дефекты, которые были допущены при подборе комплементарных оснований). Экзонуклеазная активность используется для введения в ДНК меченых нуклеотидов – НИК – трансляция.
Открытие бактериальных ферментов, обладающих эндонуклеазной активностью – рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз), значительно расширились возможности генной инженерии.
In vivo рестриктазы участвуют в системе распознавания и защиты своих и чужеродных ДНК. Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4 – 6, реже 8 – 12 нуклеотидов в 2-цепочечной молекуле ДНК и разрезают ДНК на фрагменты в местах локализации этих последовательностей (в сайтах рестрикции).
Количество образующихся рестрикционных молекул ДНК определяется частотой встречаемости сайтов рестрикции, а размер фрагментов – характером распределения сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Чем чаще расположены сайты рестрикции, тем короче фрагменты ДНК после рестрикции.
В настоящее время известно более 500 типов рестриктаз бактериального происхождения, причем каждый из этих ферментов узнает свою специфическую последовательность. Рестриктазы выделяют путем биохимической очистки из различных типов бактерий и обозначают первыми 3 латинскими буквами видов бактерий.
В зависимости от частоты встречаемости сайтов рестрикции в молекуле ДНК различают 3 класса рестриктаз:
часто шипящие
средне шипящие
редко шипящие
Рестриктазы, узнающие длинные специфические последовательности (8 - 12 п.о.) являются редко шипящими, а узнающие короткие (4 – 5 п.о.) – часто шипящие.