2.2.5. Электрофорез в агарозном геле.

Электрофорез проводили в агарозном геле. Для разных опытов использовался гель разной плотности. Состав геля представлен в табл. 2.9. Гель № 1 использовался в опытах анализы экспрессии МГЭ и для очистки зонда для Саузерн - блот гибридизации, гель №2 использовался в опытах анализы транспозиции МГЭ, гель №3 использовался для проверки качества РНК.

Табл. 2.9. Состав агарозного геля.

Название	Гель №1	Гель №2	Гель №3
Агароза	1%	0,7%	3%
Tris-acetate	40 mM	40 mM	40 mM
EDTA	1 mM	1 mM	1 mM
Ethidium bromide	0,01%	-	0,01%

Состав буфера для внесения проб в агарозный гель представлен в табл.2.10

Табл. 2.10 Состав буфера для внесения проб.

Название	Концентрация в растворе
Бромфеноловый синий	0,01%
SDS	0,5%
EDTA	0,1 М
Глицирин	50%

Напряженность электрического поля составляла 5 В/см.

Для определения линейной длины фрагментов использовался молекулярный маркер GeneRuler DNA Ladder Mix («Fermentas»).

2.2.6. Выделение днк из мух.

1. Мух в количестве 50 штук помещали в пробирку объемом 1,5 мл.

2. Гомогенизировали биологический материал с помощью тефлонового пестика до получения однородной массы в присутствии рабочего раствора (см. табл. 2.11).

Табл. 2.11 Состав рабочего раствора.

Название	Концентрация, кратность в растворе
Сток A	0,9X
SDS	1%
DEPC	1%

Табл. 2.12 Состав 1X Стока А.

Название	Концентрация в растворе
Tris HCl (pH 9,0)	0,1 M
EDTA	0,1 M

3. Инкубировали при температуре 70˚С 30 минут, добавили 5 М ацетат калия ( на 500 μl рабочего раствора 116 μl ацетата).

4. Инкубировали на льду 30 минут, центрифугировали 5 минут при 10g.

5. Добавили равный объем смеси фенола с хлороформом (1:1), центрифугировали 10 мин при 10 g.

6. Отобрали верхнюю фазу, добавили изопропанол (350 μl).

7. Инкубировали 7 минут при комнатной температуре, центрифугировали 15 минут при 10 g, супернатант сливали.

8. Добавляли 70% этанол (0,5 мл), центрифугировали 15 минут при 10 g, супернатант сливали.

9. Осадок просушивали, растворяли его в небольшом количестве воды Nuclease Free Water в зависимости от величины осадка (10-40 мкл).

10. Концентрацию ДНК измеряли с помощью спектрофотометра (фирма «Nanodrop»).

2.2.7. Рестрикция.

Рестрикцию проводили эндонуклеазами рестрикции фирмы “Fermentas” в специфических буферах, условия работы рестриктаз показаны в таблицах 2.13-2.19, состав рестрикционной смеси показан в таблице 2.20.

Табл. 2.13 Условия работы и инактивации эндонуклеаз рестрикции.

Название	Буфер, 1X	Температура реакции (⁰С)	Температура (⁰С) и время инактивации
SmaI	Tango	30	20', 65⁰
XhoI	R	37	20', 80⁰
KpnI	Unique	37	20', 80⁰
SacI	Unique	37	20', 65⁰
BamH1	Unique	37	20', 80⁰
PstI	O	37	20', 80⁰

Табл.2.20 Состав рестрикционной смеси.

Название	Кратность, количество, активность в растворе
Специфичный буфер	1X
ДНК	4000 ng
Рестриктаза	20 u