1.4.2. Ретротранспозоны с длинными концевыми повторами.

Ретротранспозоны с длинными концевыми повторами (ДКП- ретротранспозоны) имеют сходство по структуре и способу репликации с ретровирусами позвоночных. К этому классу относятся ретротранспозоны Drosophila melanogaster группы Gypsy. Впервые ретротранспозоны были обнаружены у дрозофилы в конце 70-х годов (Finnegan et al., 1978; Ilyin et al., 1978). Для ретротранспозонов характерны следующие признаки (Хесин, 1983):

1) множественность: в геноме содержится большое число копий каждого элемента, рассеянных по разным локусам хромосом, как правило, поодиночке;

2) активная транскрипция;

3) варьирующая локализация каждого элемента в геноме; она отличается у разных линий дрозофилы и даже у разных индивидуумов одной линии.

Кодирующую часть ретротранспозонов составляют открытые рамки считывания (ОРС), гомологичные ретровирусным генам gag, pol и env.

Все ДКП - ретротранспозоны можно разделить на три группы в зависимости от структуры их открытых рамок считывания (ОРС).

В первую группу входят элементы (copia, micropia), у которых продуцируется РНК, кодирующая gag-pol белковый предшественник, и сплайсированная РНК, кодирующая только gag-белок (Brierley et al., 1990). Существуют различные механизмы (ПОДРОБНО), обеспечивающие необходимое соотношение между белками gag и pol (pol-продукт необходим в гораздо меньшем количестве, чем gag).

Ко второй группе относятся ретротранспозоны, которые содержат две слегка перекрывающиеся ОРС, например такие элементы, как МДГ1, 412. содержит две слегка перекрывающиеся ОРС, кодирующие gag и pol-продукты. Эти рамки кодируют продукты gag и pol продукты. Экспрессия второй рамки считывания осуществляется в виде составного gag-pol полипептида после сдвига рибосомы при трансляции. Подобный механизм поддержания нужного соотношения между gag и pol существует и у ретровирусов.

К третьей группе относятся элементы, кодирующие три открытые рамки считывания, например элементы МДГ4, 297, 17.6, tom. Третья рамка кодирует env-подобный белок. Она экспрессируется посредством альтернативного сплайсинга основного транскрипта. Подобно ретровирусам, мобильные элементы, принадлежащие к третьей группе, способны образовывать нуклеопротеидные вирусоподобные или настоящие вирусные частицы (Shiba et al., 1983, Syomin et al., 1993).

Было показано, что на концах ретротранспозонов имеются полностью идентичные друг другу длинные концевые повторы (ДКП). Аналогичные повторы имеют в своей структуре и ретровирусы. Длина ДКП различных ретротранспозонов варьирует в интервале от 250 до 500 п.н.

Наиболее консервативные районы ДКП представлены последовательностью промотора, сайтами терминации и транскрипции и короткими инвертированными повторами на концах каждого ДКП (Arkhipova et al., 1991). Подобно ретровирусам, в кодирующей части большинства ретротранспозонов у 5'-ДКП находится сайт связывания с тРНК-праймером, а у 3'-ДКП — пурин-богатая последовательность. Длина этих последовательностей 10-18 п.н. Они необходимы для инициации синтеза "-" и "+" цепей ДНК, соответственно, во время репликации ретротранспозона за счет обратной транскрипции (Arkhipova et al., 1995).

Для перемещения элемента, сначала происходит транскрипция его последовательности. Затем происходит обратная транскрипция (синтез кДНК). В процессе обратной транскрипции образуется полная двунитевая линейная копия ретротранспозона, содержащая полноразмерные концевые повторы. Далее эта копия замыкается в кольцо и интегрируется в новые сайты генома хозяина (Arkhipova et al., 1986). Встраивание элемента сопровождается дупликацией сайта-мишени (Arkhipova et al., 1995). Абсолютная идентичность двух ДКП в одной копии ретротранспозона свидетельствует о его функциональной активности и способности к транспозиции.

По аналогии с ретровирусами можно предположить, что для интеграции ретротранспозонов требуются небольшие (от 4 до 12 п.н.) инвертированные повторы на концах ДКП, которые специфически узнаются и ступенчато расщепляются интегразой. На это указывает удвоение сайта-мишени в последовательности ДНК хозяина при интеграции в него ретротранспозона. Обычно удваивается последовательность длиной от 4 до 6 п.н. (Arkhipova et al., 1995).

Почти все ДКП-ретротранспозоны имеют сложно устроенные промоторные области, включающие в себя базальные промоторные элементы, отстоящие на несколько нуклеотидов от старта транскрипции, и дистальные промоторные элементы (энхансеры и сайленсеры), влияющие на базальный уровень транскрипции. При этом действие последних может быть тканеспецифичным и может изменяться в зависимости от стадии развития организма (Parkhurst, Corces, 1987). Большинство ДКП ретротранспозонов не имеет ТАТА-бокса (Arkhipova, Ilyin, 1992).

Характеристика открытых рамок считывания ретротранспозонов.

У ретровирусов продукты первой открытой рамки считывания gag кодируют внутренние белки вириона. У ретротранспозонов же основной функцией первой рамки считывания, вероятно, является формирование белково-нуклеиновых комплексов, так называемых вирусоподобных частиц (ВПЧ), сходных с вирусными частицами ретровирусов (Adams et al., 1987). Белок гена gag специфически связывается с транскриптами ретротранспозона. Предполагается, что образование ВПЧ способствует так же изоляции в цитозоле обратной транскриптазы и других кодируемых ретротранспозонами ферментов, что уменьшает вероятность образования потенциально вредных псевдогенов (Fink et al., 1986, Linial, 1987).

Последовательность доменов второй открытой рамки считывания и механизм сдвига рамки считывания такие же, как и у ретровирусов. Эта рамка кодирует следующие продукты: протеазу, обратную транскриптазу, рибонуклеазу Н и интегразу.

Механизм действия протеазы мало изучен. Известно, что этот фермент необходим для процесса ретротранспозиции: его белковый продукт обеспечивает специфический протеолиз полипротеинового предшественника, кодируемого ретротранспозоном, приводя к образованию более мелких белковых продуктов, соответствующих доменам Pr, RT, RNAase H, Int (Hansen et al., 1992).

Обратная транскриптаза (RT) необходима для синтеза кДНК. В результате анализа аминокислотной последовательности обратной транскриптазы было выявлено, что она имеет большое сходство с последовательностями ретровирусов и других ретроэлементов, что может свидетельствовать об их общем происхождении. В составе этих доменов выявлено 7 характерных сегментов (178 аминокислотных остатков), содержащих консервативные для большинства RT последовательности аминокислот (Xiong, Eickbush, 1990). Активность RT, различная у ретротранспозонов разных классов, вероятно, влияет на транспозиционную активность элементов (Yoshika et al., 1992).

Расположение домена рибонуклеазы в гене pol сходно у большинства ретровирусов и ретротранспозонов (Doolitle et al, 1989). Этот домен обнаруживается непосредственно вблизи домена RT и, как правило, отделен от него короткой последовательностью аминокислот. Для ретровирусов показано, что RT и RNAase H функционируют в составе одного белка; другие ретроэлементы в этом отношении, вероятно, сходны с ретровирусами.

Последним ферментом, кодируемым рамкой pol является интеграза. Она осуществляет встраивание кДНК копии элемента в геном хозяина. Интеграция вирусной ДНК в геном является сложным процессом, который включает в себя несколько последовательных стадий (процессинг концов вирусной ДНК, присоединение концов вирусной ДНК к хозяйской ДНК в сайте-мишени и репарирование разрывов). Первые две реакции осуществляются ферментом интегразой, в то время как репарирование разрывов,по всей видимости, осуществляют другие клеточные ферменты (Lewinski, 2005). В результате действия интегразы происходит дупликация нескольких пар нуклеотидов последовательности в сайте встраивания новой копии ретротранспозона.

Третья открытая рамка считывания (ген env) экспрессируется в результате альтернативного сплайсинга основного транскрипта. У ретровирусов эта ОРС кодирует компоненты, которые, ответственны за взаимодействие вирусной частицы с мембранными рецепторами клетки, в результате чего вирус проникает в нее (Varmus, Brown, 1989). Раньше считали, что основным различием ретровирусов и ретротранспозонов является именно наличие у первых гена env. Однако были обнаружены несколько семейств ретротранспозонов, имеющие эту открытую рамку считывания. К ним относятся ретротранспозоны группы Gypsy у D. melanogaster, tom у D. ananassae, Tat1 у Arabidopsis thaliana и некоторые другие.