Методика проведения стандартной пцр-реакции:

1. В пробирку последовательно добавляется:

- 33 мкл воды;

- 5 мкл реакционного буфера ( х 10 );

- 5 мкл смеси 2.5 mM dNTP;

- по 1 мкл праймеров (концентрация праймеров желательна около 1 опт. ед./мл );

- 0,5 мкл фермента;

- 1-2 мкл раствора ДНК (102-106 пг);

- 25 мкл минерального масла (масло должно полностью покрыть водный раствор во избежание испарения реакционной смеси в ходе реакции). В добавлении масла нет необходимости, если используется прибор с нагреваемой крышкой, препятствующей испарению реакционной смеси в ходе реакции.

2. Устанавливается амплификационный цикл:

Предварительная денатурация, 95°С – 5 мин;

Денатурация, 94 °С – 20-40 сек;

Отжиг праймеров, 37-68 °С – 20-40 сек; кол-во циклов 20-40

Элонгация, 72°С – 20-40 сек;

Конечная элонгация при 72 °С – 5-15 мин.

3. 5-15 мкл полученного амплификата смешать с 1-2 мкл краски для нанесения.

4. Нанести подготовленный образец на 1.5-2% агарозный гель, приготовленный с бромистым этидием.

Комментарии к методике:

1. От количества праймеров, добавляемых в реакцию, значительно зависит количество получаемого в ходе ПЦР продукта. Подбор оптимального количества праймеров отдельная и очень важная задача. Помните, праймеры весьма чувствительны к эстеразам и нуклеазам, которые могут попасть в растворы праймеров с кожи или при дыхании.

2. Чаще всего в ПЦР используют конечную концентрацию dNTP равную 250 мкМ. Допустимая конечная концентрация dNTP в реакции может быть от 15 до 350 мкМ в зависимости от конкретной задачи и длины получаемого фрагмента.

3. Допустимые количества Taq-полимеразы в реакции - 0.5 - 5 ед/проба. Разница результата в указанных пределах практически не наблюдается. Меньшие количества могут привести к ухудшению воспроизводимости Ваших результатов, большие количества не дают абсолютно никаких преимуществ.

4. Количество ДНК также важно для результативности ПЦР, как и количество праймеров. Недостаток ДНК-матрицы приводит к уменьшению выхода конечного продукта. Увеличение ДНК-матрицы в пробе приводит к появлению неспецифических полос. Оптимальное количество ДНК-матрицы в пробе - 25-150 нг.

5. Время, устанавливаемое для каждого этапа ПЦР (денатурация, отжиг, реакция), зависит от используемого прибора для проведения ПЦР. Подбор оптимальных условий, часто дело эмпирическое.

6. Для анализа получаемых фрагментов <1000 п.н. лучше использовать 2%-ый гель. Для фрагментов 1000 – 2000 п.н. - 1.5%-ый гель. Для более длинных фрагментов - 1%-ый или 0.7%-ый гель. Бромистый этидий лучше добавлять в гель при его подготовке, т.к. плотные гели плохо прокрашиваются (если окрашивать гель после электрофореза).

7. При разделении фрагментов в геле с бромистым этидием следует помнить, что подвижность фрагмента зависит от количества интеркалированного в ДНК бромистого этидия и от буфера, в котором этот фрагмент нанесен. Тоже самое относится и к используемым маркерам. Поэтому, если полученный продукт не вполне соответствует ожидаемому размеру, это еще не повод для печали.

8. ПЦР продукт может храниться некоторое время, но будет постепенно деградировать, поскольку даже самый высокоочищенный препарат полимеразы всегда содержит микропримеси нуклеаз. Время хранения увеличивается в следующей последовательности: [ Ткомн ] → [+4 °С ] → [ -20 °С ] → [ -70 °С ]. Стабильность хранения можно значительно увеличить обработав образец фенолом с последующим его переосаждением.