Выделение днк фенол-хлороформной экстракцией.

В зависимости от типа биологического материала лизис клеток осуществляется различными способами. Клетки биоматериала разрушаются различными способами, наиболее часто используемым из которых является механическое разрушение. Часто (в случае работы с растительными ибактериальными клетками) возникает необходимость применения дополнительных компонентов для избавления от клеточной стенки (лизирующие ферменты, детергенты и т. д.). После разрушения образца возникает необходимость очистки нуклеиновых кислот от других компонентов клеток. Для этого существуют различные методы, основанные на специфических свойствах нуклеиновых кислот (НК). Наиболее часто используется очистка НК методом фенол-хлороформной экстракции, основанной на различной растворимости НК в растворителях разной природы. Применение фенола и хлороформа при выделении НК способствует созданию двухфазной системы (рис.4).. Фенол отделяет белки от ДНК. Хлороформ денатурирует белок и липиды и помогает поддерживать разделение органической и водной фазы, а также делает ДНК менее растворимой в феноле. При pH 7–8, происходит растворение ДНК и РНК в водной фазе, в то время как белки образуют непрозрачный слой между фазами. В кислых условиях (рН < 5), суммарная РНК остается в верхней водной фазе, в то время как большая часть ДНК и белков остается или в интерфазе, или в органической фазе. Суммарная РНК впоследствии может быть выделена осаждением с изопропиловым спиртом. Регулируя содержание фенола и его pH, можно добиться разделения ДНК и РНК между собой, при этом ДНК будет находиться в органической фазе, в то время как РНК будет в водной фазе. На данной стадии возможно добавление изоамилового спирта, чтобы предотвратить вспенивание.

Добавление одновалентных катионов (K, Na, NH4) при выделении НК приводит к формированию соли с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. Добавление спирта (этанол или изопропиловый спирт) приводит к обратимой денатурации нуклеиновых кислот. LiCl часто использовался, чтобы денатурировать РНК, хотя осаждение со спиртом и одновалентным катионом типа натрия или иона аммония намного более широко используется. Осаждение LiCl имеет преимущества перед другими методами осаждения РНК, в которых не происходит эффективного удаления ДНК, белок или углеводы. Другое преимущество состоит в том, что литиевое осаждение эффективно удаляет несвязанные нуклеотидфосфаты, которые учитываются при количественном анализе концентрации методом спектрофотометрии.

Рис. 4. Схематичный процесс выделения нуклеиновых кислот методом фенол-хлороформной экстракции

Работа 1. Методика выделения днк методом фенол- хлороформной экстракции из лейкоцитов крови.

1. Смешать 5 мл крови с 30 мл холодного лизирующего буфера. Центрифугировать при 4000 об/мин., при +4°С в течение 20 мин. Если центрифуга без охлаждения, то предварительно подержать пробирки с кровью и лиз. буфером в морозильнике 10 минут.

2. Слить супернатант, добавить к осадку 20 мл холодного лизирующего буфера, перемешать, центрифугировать при 4000 об/мин., при +4°С в течение 10 мин.

3. Тщательно слить супернатант и ресуспензировать ядерный осадок в 800 мкл буфера для протеиназы К (Soline EDTA)

4. Перенести осадок с Soline EDTA в эппендорф на 2 мл, добавить 80 мкл 10% SDS и 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл) слегка перемешать, добавить Soline EDTA до 1 мл.

5. Инкубировать при 37°С в течение 12 часов.

6. Добавить 1000 мкл забуференного фенола (фенол-Триs-HCl, pH 7,8, меркаптоэтанол (на 50 мл фенола-Триs-HCl добавить 200 мкл меркаптоэтанола, тщательно перемешать)).

7. Перемешивать в течение 10 мин. до однородной массы на ротаторе.

8. Центрифугировать при 5 000 об/мин. в течение 10 мин.

9. Супернатант перенести в другой (новый) эппендорф, добавить 500 мкл забуференного фенола, 500 мкл хлороформа-изоамилового спирта (24 мл хлороформа: 1 мл изоамилового спирта, тщательно перемешать).

10. Перемешивать в течение 10 мин. до однородной массы не трясти!!! ( на ротаторе)

11. Центрифугировать при 5 000 об/мин. в течение 10 мин.

12. Супернатант перенести в другой (новый) эппендорф, добавить 1000 мкл хлороформа-изоамилового спирта.

13. Перемешивать в течение 5 мин. до однородной массы на ротаторе.

14. Центрифугировать при 3 000 об/мин. в течение 3 мин.

15. Супернатант перенести в коническую колбу (на 50 мл), добавить 2-3 мл охлажденного 96% этанола. Плавно перемешивать до образования «медузы» ДНК.

16. Осторожно слить спирт, оставив «медузу» в колбе.

17. Промыть осадок 2 мл 70% спирта для удаления солей, плавно перемешивая.

18. Промыть «медузу» ДНК 96% спиртом 1-2 раза,перенести в эппендорф.

19. Высушить ДНК (при комнатной температуре) и растворить в деиноз. воде или буфере ТЕ.