Работа 2. Методика выделения геномной днк с использованием стаb (гексадецилтриметиламмониум бромид).
1. Ткань растереть в ступке на холоде.
2. Перенести растертую ткань в прогретую до 65°С пробирку с 2x CTAB (из расчёта 25 мл 2x CTAB (CTAB - 2% (w/v), 1.4M NaCI, 0.1М Tris-НCI, pH 8.0, 20mM ЭДТА, довести dН2О) на 2–5 г ткани), очень хорошо и быстро перемешать.
3. Инкубировать при 65°С минимум 20 мин (лучше 1 час).
4. Охладить до комнатной температуры, добавить равный объём хлороформа : изоамилового спирта (24 : 1), перемешивать и оставить инкубироваться на 20 мин.
5. Центрифугировать на 5 000 rpm при комнатной температуре 10 мин.
6. Снять водную фазу, добавить к ней 0.2 объема 5x CTAB (CTAB – 5 % (w/v), 350mM ЭДТА, довести dН2О), перемешать и инкубировать при 65°С 10 мин.
7. Добавить равный объём хлороформ : изоамиловый спирт, инкубировать 1 мин, периодически перемешивая.
8. Центрифугировать на 5 000 rpm при комнатной температуре 10 мин.
9. Добавить равный объём буфера для преципитации (CTAB – 1 % (w/v), 0.05М Tris-НCI, pH 8.0, 10mM ЭДТА, довести dН2О) (можно и 2–3 объёма), перемешать и оставить на 1 час при комнатной температуре.
10. Центрифугировать 8 000 rpm при комнатной температуре 20 мин.
11. Растворить осадок в 1–2 мл HS-TE буфере (1M NaCI, 0.01М Tris-НCI, pH 8.0, 1mM ЭДТА, довести dН2О); добавить 2 объема 96 % этанол и инкубировать 1 час при –20С или 30 мин при –70°С.
12. Центрифугировать 8 000 rpm при +4°С 10 мин.
13. К осадку добавить 200 мкл дистиллированной H2O и 100 мкл 7.5M NH4Ac (pH 7.5) и инкубировать 20 мин при 0°С .
14. Центрифугировать 13 000 rpm при +4°С 10 мин, добавить к супернатанту 2 объема 96 % этанол и инкубировать 20 мин при –70°С.
15. Центрифугировать 13 000 rpm при +4°С 10 мин, осадок сполоснуть 80 % этанолом;
16. Растворить в TE буфере или dH2O;
17. Хранить при –20°С.
Комментарии к методике:
1. Если количество ткани небольшое, удобнее добавлять буфер непосредственно в ступку. Для совсем маленьких образцов используется пестик для микроцентрифужных пробирок.
2. Экстракция хлороформом может уменьшить объём водной фазы. В таких случаях требуется добавить 1х CTAБ буфер до исходного объёма.
Работа 3. Методика выделения рнк методом фенол- хлороформной экстракции в присутствии хлорида лития
1. Растворить образец ткани в буфере D (4M гуанидин изотиоционат, 30 мM цитрат натрия, 30 мM β-меркаптоэтанол, pH 7.0–7.5).
2. Поместить пробирку на лёд. Добавить один объём фенола и перемешать. Добавить 1/5 объёма смеси хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1) и перемешать образец. Перемешать на вортексе ещё 4 раза по 1 мин. Между перемешиваниями пробирки инкубировать на льду.
3. Открутить на максимальной скорости при +4°С в течение 30 мин. Верхнюю (водную) фазу перенести в новую пробирку.
4. Добавить 1 мкл соосадителя и 2 объёма 96% этанола. Перемешать на вортексе и немедленно открутить на максимальной скорости при RT в течение 10 мин.
5. Промыть осадок 80% этанолом и высушить на воздухе до исчезновения следов спирта. Не пересушивать!!!
6. Растворить осадок в 100 мкл деионизованной воды. Добавить равный объём 12М LiCl и охладить раствор в течение 30 мин при –20 °С.
7. Открутить на максимальной скорости 15 мин при комнатной температуре. Промыть осадок 0.8 мл 80 % этанола.
8. Осадок высушить, как описано ранее, и растворить в 40 мкл деионизованной воды, свободной от РНКаз.
9. Определить концентрацию и чистоту полученного препарата РНК.
Комментарии к методике:
1. Объем ткани не должен превысить 1/5 объема буфера D. Чтобы избегать деградации РНК, гомогенизация ткани должна быть выполнена так быстро и полностью, насколько возможно.
2. При выделении РНК может происходить загрязнение геномной ДНК. Однако, если ее количество не превышает по свечению РНК в агарозном геле с бромистым этидием, такое загрязнение не является критичным и дает возможность использовать полученный препарат РНК в дальнейшем.
3. Для хранения выделенной РНК, добавьте 0.1 объема 3М ацетата натрия и 2.5 объемов 96% этанола к РНК в воде и смешайте полностью. Образец может быть сохранен в течение нескольких лет в –20°C.
Определение качественных и количественных показателей нуклеиновых кислот
Метод определения концентрации нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) в растворе основан на существовании у ДНК и РНК максимума поглощения при длине волны 260 нм (рис. 3). Это означает, что в растворах нуклеиновых кислот максимальная фотометрическая абсорбция наблюдается при 260 нм и прямо коррелирует с концентрацией ДНК или РНК.
Рис. 5. Спектр поглощения нуклеиновых кислот при разных длинах волн
Работа 4. Определение концентрации ДНК или РНК.
При постановке измерения образец ДНК разбавляют дистиллированной водой в 40 раз (к 5 мкл раствора ДНК добавляют 195 мкл воды). Измерение поглощения при 260 нм проводят в кювете с длиной оптического пути 1 мм, используя воду в качестве контроля. Значение концентрации ДНК в исходном растворе (мкг/мкл) находят, умножая значение поглощения при длине волны 260 нм на К = 20 (К – молекулярный коэффициент экстинкции).
[ДНК] = А260 ⋅ К
РНК разбавляют водой в 10 раз (к 20 мкл раствора ДНК добавляют 180 мкл воды). Измерение поглощения при 260 нм проводят в кювете с длиной оптического пути 1 мм, используя воду в качестве контроля. Значение концентрации РНК в исходном растворе (мкг/мкл) находят, умножая значение поглощения при длине волны 260 нм на К = 4 (К – молекулярный коэффициент экстинкции).
[РНК] = А260 ⋅ К