§ 4. Пикосекундный импульсный флуорометр

Рассмотренные выше общие принципы метода импульсной флуоро- метрии позволяют сформулировать наиболее важные критерии, которыми следует руководствоваться при создании современного флуорометра. Наиболее важными характеристиками прибора явля­ются следующие.

Временное разрешение. Общеизвестно, что флуоресценция ис­пускается молекулой при ее излучательном переходе с первого сингле! но возбужденного состояния в основное (S_t 5₀-переход). Время этого перехода (время жизни Sj-состояния) определяется как свойствами исследуемой молекулы, так и внешними условиями, в которых эта молекула находится. Так, в растворах низкой кон­центрации (< 10~⁵ М) время жизни Sj-состояния красителей и пигментов, как правило, составляет единицы наносекунд. В кон­центрированных растворах красителей или в нативных биологиче­ских системах, где реализуются значительные межмолекулярные взаимодействия, время жизни Sj-состояния сокращается в десятки или даже сотни раз и может достигать нескольких пикосекунд. Следовательно, временное разрешение современного флуоромет­ра должно обеспечивать измерение длительности световых импуль­сов порядка Ю^-12 с. Так как временное разрешение прибора опреде­ляется длительностью возбуждающего импульса и частотной харак­теристикой системы регистрации, импульсный флуорометр должен быть снабжен источником пикосекундных импульсов света необхо­димого спектрального диапазона и устройствами, способными изме­рять световые сигналы пикосекундной длительности.

Чувствительность системы регистрации. Сокращение времени жизни х Sj-состояния нигментов в нативных биологических систе­мах по сравнению с т₀ Sj-состояния низкоконцентрированных раст­воров этих же пигментов, как правило, обусловлено эффективной миграцией энергии между молекулами, а также фотореакциями, в которые вступает возбужденная молекула. Эти процессы, естествен­но, конкурируют с флуоресценцией и значительно уменьшают ее длительность и квантовый выход. Например, квантовый выход флу­оресценции хлорофилла in vitro при концентрации ^ Ю^-5 М со­ставляет ~ 0,32, тогда как in vivo (целые хлоропласта) не превы­шает ~ 0,02; наконец, выход флуоресценции Хл а реакционного центра составляет величину порядка Ю^-8 — Ю^-4. Следовательно, система регистрации должна обладать пикосекундным временным разрешением и обеспечивать измерение флуоресценции, испускае­мой с квантовым выходом ~ Ю^-4.

Интенсивность флуоресценции в известных пределах пропор­циональна интенсивности возбуждающего импульса. Поэтому, на первый взгляд, абсолютный поток флуоресценции можно увеличить, повысив мощность возбуждения. В действительности сама исследуе­мая система накладывает серьезные ограничения на допустимые мощности возбуждающих световых импульсов. Так, при интенсив- ностях пикосекундиых импульсов света больше 10⁵ — 10^е Вт/см² могут реализовываться такие нелинейные явления, как синглет- синглетная аннигиляция, двухквантовые процессы и др., которые приводят к сокращению длительности флуоресценции и падению ее квантового выхода. Кроме того, при превышении определенных по­роговых мощностей возбуждения наблюдается разрушение пиг­ментированных биологических структур как следствие локального перегрева образца, развития ударных волн и т. д. Следовательно, условия эксперимента накладывают строгие ограничения на интен­сивность лазерных импульсов, используемых для измерения неис­каженных значений т. Оказывается, что с учетом выхода флуорес­ценции (Ю^-2 — 10~³) и геометрии светосбора чувствительность системы регистрации должна обеспечивать регистрацию световых потоков 10⁹ — 10¹⁰ квант/см².

Линейность и динамический диапазон. Под линейностью систе­мы регистрации понимают диапазон изменения интенсивности све­та на входе системы регистрации, при котором сигнал (световой или электрический) на выходе изменяется пропорционально входному. Динамический диапазон определяют отношением максимально ре­гистрируемой без искажения интенсивности импульса к минималь­ной на линейном участке характеристики свет/сигнал системы реги­страции. Определение этих характеристик необходимо проводить для каждой конкретной системы регистрации, чтобы корректно измерять длительность и кинетику затухания флуоресценции.

Спектральная чувствительность. Эта характеристика флуоромет- ра определяется совокупностью спектрального диапазона длин волн возбуждения и спектральной чувствительностью системы регистра­ции. Как правило, спектральную чувствительность флуорометра считают удовлетворительной, если имеется возможность возбуждать флуоресценцию в диапазонах от ультрафиолетовой до красной (250— 700 нм) частей спектра, а регистрировать соответственно от синей до ближней ИК-области (350—1100 нм).

Ниже рассмотрены основные узлы и функциональная схема им­пульсного флуорометра пикосекундного временного разрешения, созданного на кафедре биофизики Биологического факультета

Источник возбуждающего света

В качестве источника возбуждающего света используют лазер на фосфатном стекле с неодимом, работающий в режиме самосинхро­низации мод. Резонатор задающего генератора с базой 1,5 м обра­зован двумя зеркалами с коэффициентом отражения 50 и 100 %. «Глухое» зеркало (100 %) одновременно является задней стенкой кюветы, модулирующей добротность резонатора. В такой конструк­ции отсутствуют потери на паразитные отражения, которые неиз­бежно возникают при помещении в резонатор отдельно собранного модулятора. Через кювету модулятора осуществляется непрерыв­ная прокачка красителя, что позволяет генератору работать в час­тотном режиме.

В качестве активного элемента использован стержень из фосфат­ного стекла с концентрацией ионов неодима ~ 5%. Торцы стержня срезаны под углом 85°, что исключает образование дополнитель­ных резонаторов между торцами и глухим зеркалом.

Существенным недостатком лазеров с самосинхронизацией мод является плохая воспроизводимость временных и энергетических характеристик излучения от вспышки к вспышке. Чтобы повысить степень синхронизации мод, был осуществлен режим генерации, при котором нелинейные этапы просветления фильтра и насыщения усиления оказываются совмещенными во времени. Этот режим ре­ализовали экспериментально путем подбора оптимальной геометрии резонатора и начального пропускания раствора красителя в моду­ляторе. Для подавления высших поперечных мод использовали ди­афрагму диаметром 2 мм и телескоп. Кроме того, температуру ак­тивного элемента поддерживали постоянной с точностью ±0,5 °С с помощью термостата.

Сконструированный таким образом генератор с частотой 0,5 Гц производит последовательность из — 20 импульсов, следующих друг за другом с интервалом ~10 не. длина волны излучения составля­ет 1060 нм, энергия отдельного импульса в начале цуга 1—2 мДж, длительность 3—4 пс.

В импульсных флуорометр и ческ их измерениях предпочтитель­нее иметь одиночный импульс света, длину волны которого можно из­менять соответственно спектру поглощения исследуемых образцов. Поэтому с помощью электронно-оптического затвора Поккельса из цуга импульсов выделялся один с энергией на выходе затвора 0,5--1 мДж. В качестве затвора исиользовали промышленный элек­трооптический модулятор типаМЛ-102.В необходимых случаях вы­деленный одиночный импульс света усиливали, так что на выходе усилителей его энергия может достигать 50 мДж.

Для изменения частоты основного излучения неодимового ла­зера используют последовательное умножение (генерация гармо­ник) частоты в нелинейных кристаллах типа KDP. В итоге описан­ный здесь источник возбуждающего света для импульсного флуо- рометра с частотой повторения 0,5 Гц (либо в одиночном режиме) ге­нерирует импульсы света с К — 1060, 530, 353, 265 нм. Длительность отдельного импульса составляет ~3 не. Преобразование частоты в более широком спектральном диапазоне может быть достигнуто- с привлечением других нелинейных эффектов.

Система регистрации флуорометра

Наиболее распространенным прибором, прямо регистрирующим ультракороткие световые импульсы, является электронно-оптиче- ская камера (ЭОК). В настоящее время уже реализованы ЭОК с раз­решающей способностью < 1 пс. Такие устройства нашли широкое применение в исследовании характеристик пикосекундных лазер­ных импульсов. Однако с ростом временного разрешения падает чувствительность ЭОК, поэтому ее применение для регистрации коротких и слабых свечений биообъектов сопряжено с преодолением значительных трудностей.

В описываемой установке в качестве регистратора использован промышленный фотохронограф «Агат-СФ». При соответствующем подборе параметров управляющих электрических импульсов эта камера обеспечивает субпикосекундное временное разрешение. Что­бы повысить чувствительность с экраном камеры, последовательно- сопряжены одна или две усиливающие микроканальные пластины, а также вакуумный усилитель яркости, фотокатод и анод которого- нанесены на волоконные стекла. Такая ЭОК с усилителями имеет несколько худшее временное разрешение (~2 пс), однако вполне может быть использована в качестве регистратора флуоресценции в импульсном пикосекундном флуорометре.

Как отмечалось выше, корректное проведение измерений дли­тельности флуоресценции требует контроля параметров импульса возбуждения в каждом опыте. С этой целью часть энергии одиноч­ного возбуждающего импульса можно подавать непосредственно на фотокатод ЭОК с некоторым фиксированным опережением относи­тельно времени прихода флуоресценции. Этот простой способ позво­ляет постоянно контролировать аппаратную функцию прибора К (0 и обеспечивает возможность измерения относительных изменений квантового выхода образца. Для этого площади под кривыми реги­стрируемого сигнала Ф (t) и аппаратной функции, полученными после обработки изображения с выходного экрана ЭОК, калибруют в единицах энергии и их отношение будет пропорционально отно­сительному квантовому выходу флуоресценции образца.

Наиболее распространены два способа регистрации свечения эк­рана ЭОК: фотографический и фотоэлектрический. Первый способ прост и получил наибольшее распространение. Вместе с тем обще­известные недостатки, присущие фотографическому способу, яви­лись причиной поиска других, более чувствительных и быстродей­ствующих систем обработки информации, содержащейся в свечении экрана ЭОК.

Система автоматического считывания и обработки информации

Разработанная и реализованная быстродействующая система обра­ботки информации, считываемой с экрана ЭОК, состоит из телеви­зионного преобразователя свет — сигнал (телекамеры), последова­тельно сопряженной с видеомонитором, анализатором импульсов, графопостроителем и перфоратором для ввода считываемой инфор­мации в ЭВМ.

Наиболее распространенным и простым в эксплуатации преобра­зователем свет — сигнал является передающая телевизионная труб­ка с электропроводящей мишенью из фотосопротивления — ви- дикон.

Основными характеристиками видиконов являются световая характеристика свет — сигнал, разрешающая способность, отноше­ние сигнал/шум, инерционность, спектральная чувствительность.

Характеристика свет — сигнал представляет собой зависимость тока сигнала передающей трубки от освещенности на ее фотокатоде. По этой характеристике можно судить о линейности и рабочей осве­щенности фотослоя. Световые характеристики видиконов сущест­венно зависят от выбора потенциала сигнальной пластины. С уве­личением напряжения ток сигнала и линейность увеличиваются, однако одновременно растет и темновой ток, неравномерность кото­рого значительно ухудшает качество изображения. Возможность вычитания фона, выполняемая анализатором, позволяет исключить помехи, вызываемые темновым током видикона.

Под разрешающей способностью телевизионной системы пони­мают количественную оценку возможности различения мелких де­талей изображения. Анизотропность телевизионного изображения, связанная со строчной структурой телевизионного растра, приводит к необходимости отдельно рассматривать разрешающую способ­ность по горизонтали (вдоль строк) и по вертикали. Разрешающая способность в обоих направлениях зависит от структуры фотопро- водящей мишени и качества фокусировки считывающего электрон­ного луча. Разрешающая способность по вертикали определяется также числом строк в растре, а по горизонтали — зависит от шири­ны полосы пропускания усилительного тракта видеосигнала.

Отношение сигнал/шум — важнейшая характеристика преобра­зователя свет — сигнал и телевизионной системы в целом. Она опре­деляет чувствительность телевизионной системы, ее разрешающую способность, качество изображения при визуальном восприятии, возможность подключения к телевизионному каналу различных ав­томатических решающих устройств. В видиконах сигнал снимается с сигнальной пластины и шумы преобразователя оказываются гораз­до меньше шумов входного каскада усилителя. Поэтому отношение сигнал/шум телевизионной системы в основном определяется шумами усилителя.

Инерционность видикона характеризует запаздывание измене­ния сигнала на входе трубки по отношению к изменению интенсив­ности входного светового сигнала. В наибольшей степени инерцион­ность преобразователя свет — сигнал будет проявляться при пере­даче движущихся изображений. Относительно высокая инерцион­ность видиконов не является препятствием, так как изображение на выходном экране ЭОК появляется практически мгновенно (0,004—10 не) и остается неподвижным на время высвечивания лю­минофора (примерно 100—200 мкс).

Спектральная чувствительность видикона определяется зависи­мостью значения тока сигнала трубки от спектрального состава передаваемого изображения. Выходной экран используемой ЭОК, а также вакуумного усилителя яркости покрыт люминофором мар­ки К-71 с максимумом кривой спектра излучения X = 460 нм и ши­риной на полувысоте ДХ = 60 нм. В этой области спектра могут работать практически все имеющиеся телевизионные трубки.

Основным требованием, предъявляемым к видикону для считы­вания информации с экрана ЭОК, является обеспечение неискажен­ного преобразования в электрический сигнал неподвижного, но относительно короткоживущего (~0,2 мс) многомерного свечения. Интенсивность этого свечения экспоненциально снижается во вре­мени.

Коэффициент усиления современных ЭОК достигает значения 10⁵, при этом возможна регистрация каждого фотоэлектрона, ис­пущенного фотокатодом. При такой чувствительности фотоэлектро­ны на экране ЭОК видны в виде световых точек, яркость которых различна, поскольку коэффициент усиления яркости в многокамер­ной ЭОК является флуктуирующей величиной. Требования к чувст­вительности и пространственному разрешению видикона вытекают из необходимости регистрации сигнала от каждого фотоэлектрона.

При регистрации телекамерой сигналов выходного экрана ЭОК, работающей в режиме однократной развертки, можно разде­лить процессы накопления потенциального рельефа на мишени ви­дикона и его считывания. При этом рабочий цикл передающей труб­ки разбивается на два этапа: регулируемый по длительности про­цесс накопления и считывание накопленного рельефа по памяти за несколько кадров. Разделение процессов накопления рельефа и считывания приводит к значительному увеличению чувствитель­ности телекамеры.

В описываемой установке была применена телевизионная каме­ра с видиконом типа «суперкремникон» (промышленное изделие ЛИ-702). Телевизионная камера сопрягалась с экраном ЭОК таким образом, что телевизионные строки растра располагались перпен­дикулярно направлению развертки изображения входной щели ЭОК во времени, а номер строки соответствовал временной коорди­нате.

Сравнение характеристик фотопленки и телевизионных передаю­щих трубок показывает следующее. 1. В видиконе процесс преоб­разования света в энергию фотоэлектрона намного более эффекти­вен, чем аналогичный процесс преобразования фотонов в зерна се­ребра на фотопленке. 2. Фотоэффект линеен вплоть до самых низ­ких уровней света, а восприимчивость фотомишени не исчезает -скачком, подобно восприимчивости фотоэмульсии. 3. Результаты преобразования могут быть получены в виде электрического сиг­нала, который легко и удобно обрабатывать. 4. Сигнал темиового фона можно вычесть электронным способом, благодаря чему увели­чивается контраст полезного сигнала в нужном диапазоне интен- сивностей.

Спроецированный на мишень видикона световой сигнал считы- вается электронным растром за 5—10 кадров, т.е. за время, равное 200—400 мс. Этого времени недостаточно для визуальной оценки и обработки получаемой информации, поэтому необходимо примене­ние промежуточного запоминающего устройства. Таким устройст­вом может служить видеомагнитофон, ЭВМ или многоканальный анализатор.

В качестве промежуточного запоминающего устройства исполь­зован многоканальный анализатор NOKIA LP-4840, в котором предусмотрены операции покадрового суммирования, интегриро­вания, дифференцирования и вычитания нулевого уровня, а также возможность накопления данных на магнитной ленте или перфолен­те, воспроизведения накопленной информации на экране видеомо­нитора или с помощью графопостроителя.

Видеосигнал (сигнал изображения) является функцией времени, а его мгновенное значение пропорционально яркости передаваемо­го элемента изображения. Полезная часть сигнала занимает не всю •строку и может меняться в зависимости от размера входной щели ЭОК и масштаба передачи изображения щели на мишень видикона. Поэтому для устранения влияния помех на результаты необходимо применение методов временной фильтрации полезного сигнала. Кроме того, видеосигнал имеет широкий частотный спектр (~4 МГц) и складывается из полезного сигнала и шумового. Если его после усиления подать непосредственно на вход аналого-цифрового пре­образователя, то величина амплитуды видеосигнала будет с.читы- ваться лишь в одной точке огибающей полезного сигнала, а осталь­ная часть — теряться. Поэтому перед подачей на АЦП анализатора сигнал видикона подвергают преобразованию.

Наиболее широкое применение в измерительной технике полу­чили интегрирующие преобразователи (интеграторы), обладающие высокой способностью подавлять периодические и случайные шумы, а также высокой точностью, простотой схемного решения.

Видеосигнал с телекамеры подается на вход интегратора, кото­рый открывается управляющим импульсом от временного селекти­рующего устройства—ворот — и пропускает только полезную часть

снгнала. Ворота, в свою очередь, управляются кадровыми и строч­ными синхроимпульсами. После интегрирования видеосигнал уси­ливается до напряжения 4 В и подается на вход АЦП анализатора.

Ранее отмечалось, что чем выше временное разрешение ЭОК, км ниже ее чувствительность, так как плотность фотоэлектронов, попадающих на экран, обратно пропорциональна скорости разверт­ки. Очевидно, при регистрации слабых световых импульсов ульт­ракороткой длительности исследуемый сигнал будет сильно маскиро- наться фоновым свечением ЭОК, что значительно затрудняет, а по­рой делает невозможным получение полезной информации. Кроме того, динамический диапазон скоростных ЭОК довольно низок, н это накладывает определенные ограничения на возможность ис­следования гетерогенного свечения, компоненты которого имеют разные интенсивности.

Наиболее радикальным способом повышения чувствительности н увеличения динамического диапазона пикосекундного импульсно­го флуорометра с ЭОК в качестве регистратора является обеспече­ние режима накопления световых сигналов.

Схема описываемого импульсного флуорометра приведена на рис. 43.

Источником возбуждающего света служит лазер на фосфатном стекле с не­одимом (генератор), генерирующий последовательность импульсов света пи­косекундной длительности (X 1060 нм). С помощью пластинки (зеркала 3.) часть света (10 %) подается на фотокатод коаксиального фотоэлемента (фЭ). управляющего работой затвора ГТоккельса (СВОИ), служащего для вы­деления одиночного импульса света. Этот же импульс света используется для (апуска системы регистрации.

В необходимых случаях выделенный одиночный импульс света усилива­ется (У-1, У-2). Благодаря последовательному преобразованию в генераторе гармоник (IT) диапазон длин волн генерации установки представлен линия­ми 1060, 530. 353 и 265 нм, коэффициент преобразования энергии основно­го излучения (1060 нм) во вторую, третью и четвертую гармоннкн составля­ет около 60, 20 и 5 % соответственно.

Излучение соответствующей длины волны выделяется светофильтром (Ф) н используется для возбуждения флуоресценции в образце (О). Свечение флу­оресценции собирается с передней грани кюветы светосильной оптикой—кол­лиматором (К) с относительным отверстием 1:1,5. Для выделения определен­ной спектральной области служат интерференционные светофильтры (ИФ), помещаемые между образцом и входной щелью ЭОК (Щ)- Важно отметить, что в кюветной части предусмотрена возможность охлаждения образца до ге­лиевых температур. Коллиматор формирует изображение светящейся поверх­ности образца на входной щелк ЭОК.

Важным элементом импульсного флуорометра является отводная пластин­ка (3₂), с помощью которой часть энергии возбуждающего импульса пода­ется с некоторым опережением относительно времени прихода импульса флу­оресценция на фотокатод ЭОК. Именно таким образом в эксперименте осуще­ствляется контроль аппаратурной характеристической функции и энергии возбуждающего импульса.

128

Проверка линейности, динамического диапазона и временного разрешения установки осуществляется следующим образом. Оди­ночный импульс света длительностью ~ 3 пс (Я 530 нм) пропускает-

5 Зак. 583

ж

Монитор-2

Графо­построитель

	Анали­
	затор

К ЭВМ

Селектор положения опорного импульса

Рис. 4.3. Схема пикосекундного импульсного флуорометра:

Ворота 1

1
Интегратор -1	—*■

/ — источник импульсов света пикосекундной длительности, //- система регистрации./// — система автоматического считывания и обработки информации; ВС — видеосигнал. КСИ кадровый синхроимпульс. ССИ строчный синхро­импульс; остальные объяснения см. в тексте

г я через пару полупрозрачных зеркал, отстоящих друг от друга на расстоянии d. В результате получается последовательность калиб­ровочных импульсов, идущих друг за другом с временньхм интерва­лом Ai — 2d/c, где с—скорость света. Интенсивность последующего импульса l_h — Т² (1 — Т)'^гк, где Т — коэффициент пропускания зеркал, k — номер импульса. Отношение /_ktl//|, » (1 —Т)'² ниляется постоянной величиной, а огибающая импульсов будет описываться уравнением

' 1п(1 — Tf

I (t) =/_n exp

At

Калибровочный цуг импульсов подается на входную щель ЭОК п разворачивается во времени. Обработка результатов калибровоч­ных измерений показывает, что временное разрешение флуоромет- 1>а достигает 3—4 пс, динамический диапазон системы ЭОК — видикон — анализатор на линейном участке характеристики свет — сигнал составляет (для разных камер) 20—100, чувствитель­ность позволяет регистрировать световые потоки на уровне 10^s — 10⁹ квант/см².