§ 1. Основы метода импульсной флуорометрии

С момента получения пикосекундных (10~¹² с) импульсов света Г. В. Моккером и Р. Дж. Коллинзом (1965) от рубинового лазера и А. Дж. Де Марией (1966) от неодимового лазера техника их генерации непрерывно совершенствовалась. К настоящему времени методы генерации достигли такого уровня, что стало возможным надежное получение импульсов, длительность которых определяет­ся обратной шириной спектра излучения активных молекул. Так, рубиновый лазер генерирует импульсы длительностью ~ 30 пс, лазер на фосфатном стекле с неодимом пс, квазинепрерыв­ные лазеры на красителях ~0,3 пс. Процессы синхронизации мод, при которых ка выходе лазера получается последовательность им­пульсов света пикосекундной длительности, детально исследованы экспериментально и теоретически описаны в целом ряде общедоступ­ных обзоров.

Интенсивное развитие техники и теории генерации сверхкорот­ких световых импульсов определяется тем, что эти импульсы пре­доставляют уникальные возможности в изучении процессов, проис­ходящих при взаимодействии света с веществом и протекающих за 10"~¹² — Ю^-9 с. Осуществление этих исследований потребовало развития традиционных методов динамической спектроскопии (абсорбционной и флуорометрии) до качественно нового уровня;

1 КАК.

fit) ф) Kit) <t>(t)

ъ:

_fj Рис. 40. Схема метода импульсной флуорометрии:

/—импульсный источник света, 2 — светофильтры. 3 — образец. 4 — регистратор; /(f) — иозбуж дающий импульс света, cp(t) — хврактернстическая функция флуоресценции,

Kit) — аппаратная характеристическая функция, Ф(() — регистрируемый сигнал

возникли новые методы исследования с пикосекундным разреше­нием.

Импульсная флуорометрия представляет собой метод прямого наблюдения кинетики затухания флуоресценции. При этом корот­кий, достаточно мощный импульс света, попадая на образец, соз­дает высокую концентрацию возбужденных состояний исследуемых молекул, радиационная дезактивация которых во времени регист­рируется фотоприемниками. Следовательно, основными элементами импульсного флуорометра являются источник света для возбужде­ния флуоресценции, светофильтры или иные селектирующие спектр приборы и система регистрации (рис. 40).

Флуоресценция возбуждается импульсом света /(/), длитель­ность которого выбирается меньше времени жизни флуоресцентного состояния исследуемых молекул. В основе анализа регистрируемого сигнала флуоресценции лежат представления об аппаратной и ха­рактеристической функциях. Аппаратная характеристическая функ­ция (АХФ) К (t) определяется как частотной характеристикой си­стемы регистрации, так и параметрами возбуждающего импульса / (t). Вид АХФ легко установить, если на вход системы регистра­ции подать импульс света от источника возбуждения и зарегистри­ровать сигнал на выходе.

При измерении длительности флуоресценции на выходе регист­рирующей системы детектируется сигнал Ф (t), который можно пред­ставить в внде свертки характеристической функции флуоресцен­ции ф (t), определяемой как интенсивность флуоресценции, воз­буждаемой в момент времени t = 0 6-образным импульсом света, и АХФ К (t):

+ <*>

ф(0= J K(t — t')v(t')dt'. (III.1.1)

Таким образом, экспериментально измеряемыми являются функ­ции К (0 и Ф (t), тогда как в действительности необходимо опре­деление функций ф (/). К сожалению, никакого удобного аналити­ческого метода нахождения функции <р (t) по экспериментально наблюдаемым К (0 и Ф (t) не существует и на практике используют различные приближения.

Если АХФ К (0 можно считать 6-функцией по отношению к Ф (if), то уравнение (III.1.1) легко упрощается:

оо оо

Ф(/)= j K(t—t')v(t')dt' ^ j 6(t-t')<p(t')dt'=<p(f).

— оо — оо

Иными словами, регистрируемый сигнал Ф (if) является характе­ристической функцией флуоресценции и обработка результатов из­мерений крайне проста.

В том случае, когда длительности АХФ и флуоресцентной ха­рактеристической функции сравнимы, нахождение ф (t) по К (t) и Ф (if) более трудоемко. Рассмотрим процедуру определения Ф (/), для случая, когда ее можно представить в виде суммы экспо­нент:

т | f)f <"" А

Ф' (*) = »<*) 2 A_he~^t,xb; 8(9= ([II. 1.2)

k=\ \ 1, о о,

где A_h и х^ — искомые параметры, т — число компонентов. В этом случае модельная кинетика определяется следующим обра­зом:

Ф^с (Л, T_h) = У к (t-f) Ф^с ю dr. (III. 1.3)

— оо

Введем функционал среднеквадратичной ошибки

F = ^dJ; ^=ФГ^п-Ф5(Л,тД (III.1.4)

i = 1

где ф-^ксп — экспериментальные значения функции Ф (if), полу­чаемые из измеренных кривых в момент времени t ~ i\ в эти же моменты времени Ф/ (A_h, xj — значения модельной кривой.

Алгоритм подбора модельной кинетики основан на минимиза­ции функционала среднеквадратичной ошибки, который представ­ляет собой сложную функцию параметров A_h и r_k, k = 1, ..., т, где т — число компонентов.

Существует много способов минимизации функционалов, завися­щих от нескольких переменных. Один из вариантов обобщенного метода Ньютона — метод затухающих наименьших квадратов Ле- венберга — обеспечивает, с одной стороны, высокую сходимость, а с другой — обладает высокой устойчивостью к неточности задания начальных значений параметров, так как при приближении к ми­нимуму вариации параметров затухают.

На начальном этапе решения задачи в память машины вводят экспериментальную кинетику, аппаратную функцию, число компо­нентов т, начальные значения параметров А_к, т_м, k — 1, ...,т. При этом число компонентов выбирают с учетом априорных данных об исследуемой системе; в процессе вычислений параметры можно фиксировать, что полезно при подборе начального прибли­жения. Вычисления производят до тех пор, пока функционал сред­неквадратичной ошибки не станет меньше величины, характери­зующей норму ошибок эксперимента.