3. Культивирование вирусов в культурах клеток.

Подавляющее большинство вирусов способно размножаться на культурах клеток. Для приготовления культур клеток используют ткани человека, различных животных и птиц. Наибольшее практическое применение получили культуры клеток из эмбриональных и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих по сравнению с нормальной тканью взрослого организма, более активной способностью к росту и размножению. В зависимости от техники приготовления и культивирования вирусов различают три основных типа культур клеток и тканей:

1) однослойные культуры клеток;

2) культуры суспензированных клеток;

3) органные культуры.

Наибольшее практическое применение получили однослойные

культуры.

Однослойные культуры клеток.

Растут на поверхности лабораторной посуды в виде монослоя клеток. Подразделяются на: первичные (первично - трипсинизированные) - способны размножаться однократно, перевиваемые (стабильные) - способны перевиваться в лабораторных условиях в течение неопределенно долгого срока, и полуперевиваемые - способны размножаться 40-50 пассажей.

1. Первичные культуры клеток. Получают путем трипсинизации тканей (например, куриного эмбриона или его оболочек, почки обезьян и других тканей). Трипсин разрушает межклеточные ткани и разобщает клетки. Подготовленную ткань заливают 0,25% раствором подогретого трипсина и инкубируют в термостате при 37 °С. Во время инкубации ткань периодически помешивают путем вращения колбы. Трипсинизированные клетки центрифугируют при 800-1000 об/мин в течении 5 минут. Трипсинизацию и центрифугирование проводят очень осторожно, чтобы не травмировать клетки. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок клеток помещают в небольшой объем питательной среды. Для получения однородной массы клеток фильтруют через один слой марли в воронке (стерильной). Взвесь клеток проверяют на стерильность путем посева по 0,1 мл в две пробирки с сахарным бульоном. Для выращивания культуры клеток необходима питательная среда. Состав среды сложный, включает в себя: аминокислоты, глюкозу, витамины, минеральные соли, коферменты и т. д. Получение культуры тканей проводят в строго асептических условиях. В среду добавляют антибиотики (500 ЕД пенициллина и 250 ЕД стрептомицина) для подавления роста бактериальной флоры. Успех культивирования клеток зависит от посевной дозы, поэтому после трипсинизации производят подсчет клеток в камере Горяева. После подсчета взвесь клеток разводят питательной средой из такого расчета, чтобы в 1 мл содержалось 500 000-1000000 клеток, и разливают по пробиркам и матрацам. Пробирки с культурой ткани инкубируют в термостате в наклонном положении. Посеянные культуры ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера их роста. Нормальные пролифелирующие клетки светлые и растут однослойным пластом. Если клетки темные, зернистые и не пролифелируют, что может быть результатом загрязнения, то такие культуры изымают из опыта. Смена питательной среды через 2-3 дня после посева улучшает интенсивность пролиферации. Нормальные, хорошо пролифелирующие клетки заражают исследуемым материалом. Первичные культуры, как правило, используют однократно (например, для получения вакцинных штаммов вируса полиомиелита).