Практическая работа №3

Тема: «Микроскопические методы исследования. Методы окрашивания препаратов»

Способы приготовления препаратов для микроскопии.

При помощи светового микроскопа можно изучать микроорганизмы, как в живом, так и в окрашенном виде. При исследовании микробов в живом состоянии можно получить представление о размере, форме и характере их движения. Иногда внутри живой клетки видны блестящие, сильно преломляющие свет гранулы и споры. Для изучения микробов в живом состоянии готовят препараты висячей и раздавленной капли.

Препарат висячей капли.

Для приготовления препарата висячей капли бактериологической петлёй в центр покровного стекла наносят небольшую каплю исследуемого материала, суспендированного в жидкости (изотонический раствор хлорида натрия – 0,9% NaCl). Затем берут специальное стекло с лункой в центре и края её смазывают вазелиновым маслом. Лункой предметного стекла накрывают каплю исследуемого материала на покровном стекле, так чтобы капля находилась в центре лунки. Слегка прижимают предметное стекло и быстро переворачивают. При правильном приготовлении препарата капля свисает в лунку. Вазелиновое масло предохраняет каплю от высыхания.

Препарат раздавленной капли.

Препарат готовят нанесением капли суспендированного в жидкости материала на предметное стекло, которое затем накрывают покровным.

Приготовление мазка.

Для изучения морфологии микроорганизмов, деталей их структуры используют метод окраски их анилиновыми красителями. Исследуемый материал разводят изотоническим раствором хлорида натрия (0,9% NaCl), маленькую каплю размазывают тонким слоем по предметному стеклу на площади диаметром 1 см и высушивают. Такой препарат называется мазком. Его фиксируют на пламени горелки, если исследуют бактерии или метиловым либо этиловым спиртом при микроскопии простейших, риккетсий, спирохет.

Окраска микроорганизмов.

Для выявления спор, капсул, жгутиков, различных структур и органелл, а также сходных по форме бактерий использование простого способа окраски бывает недостаточно. Поэтому существуют сложные, специальные методы окрашивания.

Способ окрашивания по Грамму.

Позволяет дифференцировать сходные по форме и размерам бактерии, относящиеся к разным родам и видам. Мазок, приготовленный из исследуемого материала, окрашивают вначале кристаллическим фиолетовым в течении 1-2 минут, а затем раствором Люголя 1-2 минуты. Все микроорганизмы находящиеся на мазке приобретают темно-фиолетовый цвет. После этого мазок обрабатывают 96% этиловым спиртом в течении 30-60 секунд, смывая остатки спирта водой; под действием спирта одни бактерии обесцвечиваются, а другие сохраняют фиолетовую окраску, приданную им комплексом красителей с йодом. Те виды микробов, которые сохраняют фиолетовую окраску, называют грамположительными, а обесцвечивающиеся – грамотрицательными. После дополнительной окраски фуксином последние окрашиваются в красный цвет.

Необходимо помнить, что на результаты окраски по Грамму часто влияют небольшие отклонения в условиях культивирования или в методике окраски.

Старые культуры или отмирающие клетки грамположительных бактерий могут стать грамотрицательными.

По отношению к окраске по способу Грамма все бактерии делятся на две группы:

1 группа. Грамположительные (стафилококки, стрептококки, пневмококки, возбудители сибирской язвы, столбняка, газовой гангрены).

2 группа. Грамотрицательные (менингококки, гонококки, возбудители брюшного тифа, дизентерии).

В механизме окраски по Грамму имеют значение особенности химического состава микроорганизмов, различия в проницаемости клеточных стенок, наличие рибонуклеата магния у грамположительных бактерий; между большинством грамположительных и грамотрицательных бактерий существуют отличия в чувствительности к сульфаниламидам, пенициллину и лизоциму.

Способ окраски по Цилю - Нильсену.

Способ окраски предложен для кислотоустойчивых микроорганизмов - микобактерий туберкулёза и лепры. Эти микроорганизмы имеют своеобразный химический состав, отличающийся высоким (до 30-40%) содержанием особых жироподобных веществ (воски). Предварительно фиксированный на пламени мазок из мокроты больного туберкулёзом окрашивают раствором карболового фуксина при дву- или трёхкратном подогревании до появления паров. Благодаря размягчению воска краска проникает в клетку и удерживается в ней даже при последующей обработке препарата 5% серной кислотой в течении 3-5 секунд, поэтому кислотоустойчивые микобактерии остаются окрашенными в красный цвет. Остальные бактерии обесцвечиваются под действием кислоты. При дальнейшем окрашивании метиленовым синим, они становятся синими.

Для окраски спор, которые при обычных способах окраски имеют вид неокрашенных пустот, применяют протравы: кислоты и щелочи.

Они разрыхляют плотную оболочку споры и облегчают проникновение через неё краски. Окрасившиеся споры обладают кислотоустойчивостью и не обесцвечиваются под действием кислоты в отличие от вегетативного тела микробной клетки. Поэтому принцип окраски спор и кислотоустойчивых бактерий одинаков. Споры можно окрасить по методу Циля-Нильсена (споры красные, вегетативное тело - синее) или по Ожешко.

Способ окраски по Ожешко.

Для проведения окраски на высушенный, но нефиксированный мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлористоводородной или серной кислоты и подогревают над пламенем горелки в течении 1-2 минуты до закипания. Остатки кислоты сливают, препарат высушивают, фиксируют в пламени. Дальнейшую окраску производят по методу Циля-Нильсена.

Способ окраски по Романовскому - Гимзе.

Данный способ окраски применяют для изучения простейших, а также спирохет и риккетсий. Используемая краска состоит из смеси азура, эозина, мителенового синего. Непосредственно перед употреблением её растворяют дистиллированной или проточной водой (рН 7,0 - 7,2) из расчета 1:10. Препарат фиксируют этиловым или метиловым спиртом в течение 5-15 минут, окрашивают 30-40 минут, высушивают и микроскопируют. Ядро простейших, жгутики и блефаропласт окрашиваются в ярко-синий цвет, цитоплазма - в голубой, спирохеты и риккетсий - в сиреневато-синий.

Окраска по Бурри - Гинсу (выявление капсул).

Этот метод назван негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула остается неокрашенной.

1. На предметное стекло наносят каплю чёрной туши, разведённой в 10 раз. В неё вносят каплю культуры. Ребром шлифованного стекла делают мазок, также как мазок крови и высушивают.

2. Фиксирую спиртом или сулемой. Осторожно промывают водой.

3. Окрашивают фуксином Пфейфера 3-5 минут. Осторожно промывают и высушивают на воздухе. Микроскопия препаратов проводится с помощью иммерсионной системы. Фон препарата - черный, клетки - красные, капсулы - не окрашены.

а) Шаровидные бактерии:

1-стафилококки (окраска по

Грамму)

2-стрептококки (окраска по

Грамму)

3-пневмококки (окраска по Бури-

Гинсу)

4-менингококки и гонококки

(окраска по Грамму)

б) Палочковидные бактерии:

1-кишечные палочки (окраска по

Грамму)

2-возбудитель дифтерии (окраска

мителеновым синим)

3-Возбудитель туберкулёза (окраска

по Цилю-Нильсену)

4-возбудитель столбняка (окрска по

Ожешко)

5-холерный вибрион (окраска по

Грамму)

в) Спирохеты:

1- бледная трепонема

2-спирохета возвратного тифа

3-лептоспиры

Методы приготовления мазков – препаратов из

материала (культур)

и способы их окрашивания.

Мазки-препараты готовят из патологического материала (например, из гноя, мокроты, фекалий), колоний или из налёта чистых культур бактерий, и грибков, выросших на питательных средах в чашках Петри или пробирках. Делают мазки на предметных стёклах, как правило, бактериальной петлей (диаметр 3x2 мм) из нихромовой проволоки, конец которой закрепляют зажимом в специальном петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Для изготовления мазков необходима газовая горелка или спиртовка, ванночка с подставкой (мостик) для стёкол, промывалка с водой, флакон с физиологическим раствором, красители, фильтровальная бумага, банки с дезинфицирующим раствором для обезвреживания отработанных препаратов, пипеток, материалов и рабочего стола.

Этапы приготовления мазка:

1. Исследуемые материалы и культуры микробов берут бактериальной петлёй, которую стерилизуют в пламени горелки. При введении петли в пробирки и колбы стерилизуют также верхнюю часть петледержателя. Края горлышка пробирки стерилизуют в пламени горелки и почти одновременно обжигают петлю, которую быстро вводят внутрь пробирки, охлаждают и прикасаются к налёту на скошенном питательном агаре или же погружают её в культуру. Затем петлю извлекают, быстро обжигают край пробирки и, закрывают пробкой и ставят пробирку в штатив.

2. Налёт чистой культуры микробов или колонию эмульгируют в капле воды на предметном стекле и круговыми движениями петли равномерно распределяют на площади 1,0 - 1,5 см. Точно такого же размера готовят мазок из бульонной культуры, гноя, мокроты и др. материалов, которые не взвешиваются в воде. Хорошо приготовленные мазки имеют округлую форму, быстро высыхают при комнатной температуре, более толстые -высушивают в термостате или подогревают над пламенем горелки, не допуская свёртывания белка бактерий и нарушения их структуры.

3. Высушенные мазки фиксируют 5 - 6 секунд в пламени спиртовки для того, чтобы убить микробов, закрепить их на предметном стекле и предотвратить смыв при ополаскивании во время окраски мазка.

Для приготовления мазков из гноя и мокроты, вязких консистенций пользуются двумя предметными стеклами. На середину одного из них наносят небольшое количество материала, который покрывают вторым стеклом так, чтобы осталась свободной треть первого и второго стекол. Раздвигают стекла в стороны, получают два больших мазка одинаковой толщины.

Мазки из крови готовят следующим образом. Стерильной иглой для инъекций делают укол на предварительно продезинфицированном безымянном пальце левой руки. Первую каплю крови удаляют ватой, вторую наносят на край хорошо обезжиренного предметного стекла. Мазки делают узким шлифовальным стеклом, установленным под углом 45 градусов, продвигая его вдоль предметного стекла влево, не доходя до края.

Препараты-отпечатки из внутренних органов трупов, мяса, колбасных изделий, получают, прикасаясь предметным стеклом к поверхности разрезов, выполненных стерильным скальпелем.

4. Фиксированные мазки окрашивают кислыми, щелочными и нейтральными анилиновыми красителями. Наиболее широкое применение нашли - основной и кислый фуксин, метиленовый синий, генцианвиолет и везувин.

Простой способ окраски мазков производится водным фуксином Пфейффера и метиленовым синим Леффлера. Готовят водный фуксин из фенолового фуксина Циля, разводят его дистиллированной водой.

После окрашивания красители сливают, препарат промывают водой и высушивают между листами фильтровальной бумаги. На сухой мазок наносят каплю масла и микроскопируют с использованием иммерсионного

объектива оптического микроскопа. Способность микробов воспринимать красители называется тинкториальными свойствами.

При сложных методах окраски мазков применяют два-три различных по цвету красителя, что позволяет дифференцировать микробы и выявить некоторые нюансы в деталях их строения. К таким методам относят окраску по Грамму, Цилю - Нельсену, Нейссеру, Бурри - Гинсу, Романовскому - Гимзе и некоторые другие.

Мазок для люминесцентной микроскопии готовят обычным образом, фиксируют в ацетоне 5-10 минут и наносят на него флюорохром на 20- 30 минут. Сделанный препарат 15-20 минут промывают проточной водой, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Для электронной микроскопии вместо предметных стёкол применяются тонкие плёнки-подложки, незначительно поглощающие электроны.

Они крепятся на опорные сетки. Исследуемый материал, тщатеьно

очищенный от различных примесей, наносят на плёнку.

Высушенный препарат микроскопируют.

Контрольные вопросы.

1. Как приготовить мазок препарата?

2. Назовите цели и способы фиксации мазков?

3. Назовите основные красители?

4. Какими методами изучают подвижность микроорганизмов?

5. Назовите и охарактеризуйте сложные методы окрашивания?