- •Общая организация митотических хромосом
- •Часть I. Введение. Предмет клеточной биологии
- •Глава 1. Клеточная теория
- •1. Клетка – элементарная единица живого
- •2. Клетка – единая система сопряженных функциональных единиц
- •3. Гомологичность клеток
- •4. Клетка от клетки
- •5. Клетки и многоклеточный организм
- •6. Тотипотентность клеток
- •Глава 2. Методы клеточной биологии
- •Световая микроскопия
- •Витальное (прижизненное) изучение клеток
- •Изучение фиксированных клеток
- •Электронная микроскопия
- •Контрастирование корпускулярных объектов
- •Ультрамикротомия
- •Фракционирование клеток
- •Часть II. Строение и химия клеточного ядра Глава 3. Центральная догма молекулярной биологии
- •Глава 4. Морфология ядерных структур Роль ядерных структур в жизнедеятельности клетки
- •Ядерные компоненты прокариот
- •Ядро эукариотических клеток
- •Эухроматин и гетерохроматин
- •Хромосомный цикл
- •Общая морфология митотических хромосом
- •Клеточный цикл эукариот
- •Эндорепродукция и полиплоидия
- •Глава 5. Структура и химия хроматина
- •Основные белки хроматина - гистоны
- •Нуклеосомы при репликации и транскрипции
- •Второй уровень компактизациии – 30 нм фибрилла
- •Негистоновые белки
- •Глава 6. Ядерный белковый матрикс Общий состав ядерного матрикса
- •Днк ядерного белкового матрикса
- •Четвертый – хромонемный уровень упаковки хроматина
- •Глава 7. Общая организация митотических хромосом
- •Часть III
- •Глава 8. Ядрышко – источник рибосом
- •Ядрышко во время митоза: периферический хромосомный материал
- •Глава 9. Нерибосомные продукты клеточного ядра Транскрипция нерибосмных генов
- •Морфология рнп-компонентов в ядре
- •Глава 10. Ядерная оболочка
- •Часть IV. Цитоплазма
- •Глава 11. Гиалоплазма и органеллы
- •Глава 12. Общие свойства биологических мембран
- •Глава 13. Плазматическая мембрана
- •Клеточная стенка (оболочка) растений
- •Глава 14. Вакуолярная система внутриклеточного транспорта
- •Глава 15. Аппарат (комплекс) Гольджи
- •Глава 16. Лизосомы
- •Глава 17. Гладкий ретикулум и другие мембранные вакуоли
- •Часть V. Цитоплазма: системы энергообеспечения клеток
- •Глава 18. Митохондрии – строение и функции
- •Глава 19. Пластиды
- •Часть VI. Цитоплазма: Опорно-двигательная система (цитоскелет)
- •Глава 20. Промежуточные филаменты
- •Глава 21.Микрофиламенты
- •Глава 21. Микротрубочки
- •Глава 23. Клеточный центр
- •Двигательный аппарат бактерий
- •Часть VII. Механизмы клеточного деления. Глава 24. Митотическое деление клеток. Общая организация митоза
- •Различные типы митоза эукариот
- •Центромеры и кинетохоры
- •Длительность фаз митоза
- •Глава 25. Мейоз
- •Глава 26. Регуляция клеточного цикла
- •Фактор стимуляции митоза
- •Циклины
- •Регуляция клеточного цикла у млекопитающих
- •Глава 27. Гибель клеток: некроз и апоптоз
- •Апоптоз
Морфология рнп-компонентов в ядре
Вся информация, полученная о морфологии транскриптов рРНК и иРНК, об информоферах и сплайсосомах получена на изучении выделенных из ядер этих компонентов, подвергнутых специальной обработке для распластывания их на препаратах для электронной микроскопии.
Что же касается морфологии РНП-продуктов in situ, в объеме интактных ядер, то здесь информация неполная и противоречивая.
Кроме хорошо выраженного ядрышка, другие продукты ядерной активности при изучении клеток на ультратонких срезах не бросаются в глаза: их трудно отличить от различных фибрилл (ДНП, матрикс)и каких-то гранул, казалось бы без особого порядка разбросанных в ядре. Все же, используя метод избирательного контрастирования солями урана структур, содержащих РНК, удается выделить ряд компонентов, которые можно отнести к неядрышковым продуктам транскрипции. Это – перихроматиновые фибриллы, перихроматиновые гранулы и интерхроматиновые гранулы (рис. 99б, 100).
Перихроматиновые фибриллы обнаруживаются по периферии участков конденсированного хроматина (околомембранного или любого другого). Они имеют толщину около 3-5 нм, часто образуют рыхлую неправильную сеть. Оказалось, что этот компонент ядра сильно изменяется при стимуляции синтеза РНК. Так, при возрастании синтеза РНК в клетках печени крыс после голодания и последующего питания или после введения кортизона адреналэктомированным животным зоны перихроматиновых фибрилл значительно увеличиваются. Эти зоны оказались наиболее активными по включению меченых предшественников в РНК, что было показано радиоавтографически с помощью электронного микроскопа. Такие фибриллы могут представлять новосинтезированную гяРНК.
Другой тип РНК-содержащих структур интерфазного ядра - перихроматиновые гранулы. Они имеют диаметр около 45 нм и окружены светлым ореолом. Эти гранулы встречаются только на периферии конденсированного хроматина, в диффузном хроматине их нет. Считается, что между этими гранулами и перихроматированными фибриллами существует структурная связь. При больших увеличениях внутри гранул можно видеть тонкие извитые фибриллы 3-5 нм толщиной.
Крупные гранулы типа перихроматиновых встречаются в специфических активных в отношении синтеза РНК участках политенных хромосом, в пуффах (см. ниже). Сходные гранулы обнаружены в боковых петлях функционирующих мейотических хромосом. Исходя из этого, некоторые исследователи делают предположение, что такие рибонуклеопротеидные гранулы могут представлять собой зрелые комплексы из нескольких информофер, рибонуклеопротеидные частицы, содержащие информационную РНК. Однако это предположение нуждается в проверке.
Интерхроматиновые гранулы - третий тип РНК-содержащих структур. Они имеют размер 20-25 нм и группируются всегда в форме скоплений между участками хроматина. Эти гранулы не стандартны по величине и переплетены тонкими фибриллами.
В последнее время были получены антитела к мяРНП. Оказалось, что среди них есть и различные сплайсосомы, гранулы размером 20-30 нм. Эти мяРНП располагались в зонах свободных от конденсированного хроматина и по своей локализации совпадали с зонами, где располагались скопления интерхроматиновых гранул. Они могут представлять собой скопление сплайсосом, участвующих в конечных стадиях созревания гяРНК.
В таком случае всю картину динамики синтеза гяРНК можно представить себе следующим образом. Деконденсирующиеся участки хроматина (эухроматин) по периферии конденсированных зон хроматина, связываясь с РНК-полимеразой II, транскрибируют гяРНК в виде начальных перихроматированных фибрилл, связывающихся с белками информофер, которые затем подвергаясь созреванию с участием сплайсосом (интерхроматиновые гранулы), дают начало зрелым формам иРНК - комплексам информофер, или перихроматиновым гранулам. Вероятно, не все зрелые иРНК могут переходить в крупные (45-60 нм) перихроматиновые гранулы, а последние, вероятно, характерны для РНК с высоким молекулярным весом.
Иную топографию в интерфазных ядрах имеют РНП-продукты растительных клеток. Так, в ядрах с хромонемной организацией интерфазного хроматина, РНП в виде крупных гранул (20-30 нм) и тонких фибрилл (6-8 нм) располагается по периферии такого конденсированного хроматина и в межхроматиновых зонах; создается впечатление, что вся периферия хромонемных участков хроматина вовлечена в синтез РНК (рис. 100б).
Были сделаны попытки изучить морфологию транскрипции нерибосомных генов на тотальных плоскостных препаратах. Для этого из гомогенатов ядер осаждали фракцию диффузного хроматина, обогащенного включенными мечеными предшественниками РНК. Активный хроматин на таких препаратах имел вид типичных нуклеосомных фибрилл с редко сидящими одиночными гранулами РНК-полимеразы, от которых отходили транскрипты РНК разной длины и конфигурации (рис. 101). Обычно это были изогнутые фибриллы, иногда имеющие на свободном конце глобулярные образования. Чаще всего расстояние между одиночными гранулами РНК-полимеразы доходило до 0,1-0,3 мкм, так что представлялось, что с гена транскрибируется лишь одна копия, в отличие от множественных копий, получаемых с генов рРНК. Но однако, в редких случаях обнаруживались участки хроматина с тесно расположенными РНК-полимеразами, от которых отходили в сторону транскрипты разной длины, образуя “елочко”-подобные структуры.
Попытки наблюдать морфологию транскрипции на определенных генах были сделаны на целом ряде объектов, включая политенные хромосомы двукрылых насекомых и мейотические профазные хромосомы.
Синтез РНК в пуфах политенных хромосом
Более полные представления о морфологии синтеза и образования конечных продуктов транскрипции определенных генных участков интерфазных хромосом были получены при изучении политенных хромосом.
Светооптическое изучение строения политенных хромосом двукрылых обнаружило, что кроме дисков и междисковых участков встречаются локальные расширения хромосом, т.н. пуфы. В этих участках ДНК не располагается в виде дисков, они имеют аморфную структуру, часто содержат РНК, базофильны. В пуфах происходит основное включение 3Н-уридина, что однозначно показывает, что они являются активными участками этих своеобразных интерфазных хромосом.
Количество пуфов и их локализация не являются постоянной характеристикой той или иной политенной хромосомы. Более того, рисунок пуфирования (т.е. расположение пуфов на хромосомах) разный на одной и той же хромосоме в зависимости от стадии развития личинки, или от типа клеток, взятых для исследования.
Так как возникновение пуфов прямо связывается с активацией синтеза РНК, то было показано, что развитие определенного пуфа отражает собой активацию отдельного или группы генов, детерминирующих функционально-метаболические особенности клеток на данном этапе развития. Поэтому в различных дифференцированных клетках картина пуффинирования не должна совпадать, что и наблюдается на самом деле (рис. 102).
При затухании синтеза РНК пуф начинает спадаться, уменьшаться в размерах, терять базофилию и в конце концов на его месте можно видеть диск, из которого он развился. Особенно демонстративно это видно на особо крупных пуфах 4-ой хромосомы Chironomus, которые носят название колец Бальбиани (КБ). Так на личиночной стадии можно видеть на 4-ой хромосоме вблизи от ядрышка два постоянных базофильных пуфа, КБ1 и КБ2.
В электронном микроскопе было обнаружено, что зона этих крупных пуфов содержит большое количество гранул рибонуклеопротеидной природы, размером 50-60 нм. Эти гранулы, предположительно содержащие информационную РНК и соответствующие информосомам в составе кольца Бальбиани 2 (КБ2), располагаются особым образом. На ультратонких срезах можно наблюдать, что они располагаются рядами вдоль осевых элементов. Каждая гранула оказалась связанной с осевой структурой с помощью ножки-фибриллы толщиной 14-16 нм (рис. 103). Эта картина соответствует предположению, что 50-60 нм гранулы представляют собой РНП-продукты данного хромосомного локуса, находящиеся в процессе их синтеза. На плоскостных препаратах по Миллеру такие участки КБ2 были представлены многочисленными “елочко”-подобными структурами, состоящими из осевых компонентов и отходящих от них многочисленных гигантских траснкриптов, имеющих длину до 7,7 мкм. От участка транскрипции в данном случае отходит в среднем 123 гигантских транскрипта, связанных с комплексами РНК-полимеразы.
Расшифровка этих морфологических наблюдений стала возможной при анализе индивидуальных РНК, выделенных из КБ2. Для этого с помощью микроманипулятора выделяли ядра, затем отделяли от других 4-ую хромосому, и с помощью микродиссекции вырезали и накапливали зоны, содержащие КБ2. Затем из этих пуфов выделялась РНК, которая исследовалась с помощью гель-электрофореза. Выделенная РНК оказалась огромных размеров, она имела мол. вес 15-35 х 106 Д, и коэффициент седиментации 75S. Соответственно гены этой 75S РНК содержат 37 т.п.н., вероятно не имеют интронов, т.к. 75S РНК не подвергается процессингу и служит матрицей для синтеза гигантских молекул секреторных белков. Гены 75S РНК оказались построены наподобие сателлитных ДНК: в их составе наблюдается иерархия внутренних повторов.
После завершения синтеза 75S РНК, ее молекулы в виде крупных (50-60 нм) РНП-гранул транспортируются в цитоплазму. Однако значительная их часть разрушается: только 4-7% этой РНК обнаруживается в цитоплазме. Эти гигантские молекулы РНК образуют в цитоплазме особо крупные полисомы (700S), в состав которых входит 55-65 рибосом, на которых синтезируются длинные цепочки гликопротеидов клеток слюнной железы мотыля. (На самом деле эта железа не участвует в пищеварении, она не содержит ферментов; ее функция заключается в синтезе белка, необходимого личинке для построения домика и ловчих сетей).
Транскрипция на мейотических хромосомах
Мейотические хромосомы типа “ламповых щеток” (см. ниже) встречаются главным образом на стадии диплотены мейоза, как у самцов, так и у самок. По сравнению с митотическими хромосомами мейотические хромосомы типа ламповых щеток намного длиннее и хорошо видны в световом микроскопе по двум причинам: она представляют собой спаренные и удвоенные хроматиды, так что в их состав входит четыре продольных субъединицы. Но отличительной особенностью этих хромосом является наличие боковых петель, отходящих от множества хромомеров, попарно-симметрично располагающихся вдоль каждого гомолога (рис. 104). Именно в петлях хромосом типа ламповых щеток происходит синтез РНК во время длительной мейотической профазы.
Следовательно, хромосомы типа ламповых щеток занимают как бы промежуточное положение между инактивированными максимально конденсированными хромосомами и активными интерфазными хромосомами: конденсированные участки хромомеров соответствуют участкам митотических хромосом, а боковые петли - участкам активных интерфазных хромосомных районов. Считается, что число боковых петель соответствует числу хромомеров, за исключением того, что хромомеры, представляющие центромерные участки, петель не несут. Так у гребенчатого тритона, чьи хромосомы типа ламповых щеток особенно подробно изучены, насчитывается около 5000 хромомеров на гаплоидный набор и соответственно 20 000 боковых петель на диплотенную митотическую хромосому (напомним, что в профазе мейоза клетки содержат тетраплоидное количество хроматид).
Латеральные или боковые петли в составе хромосом типа ламповых щеток неоднородны по своей структуре. Преобладают ординарные или нормальные петли длиной около 10 мкм. Они асимметричны по своей толщине: в световом микроскопе видно, что один из концов петли тонкий, а другой толстый; развернутая петля имеет клиновидную форму. В составе ординарных петель в световом микроскопе видно, что каждая петля покрыта как бы чехлом или матриксом, имеющим неясную гранулярно-фибриллярную структуру.
ДНК входит в состав осевого элемента петель и представляет собой основную хромосомную ДНК. Это доказывалось тем, что как боковые петли, так и осевые компоненты диплотенных хромосом рвутся при обработке ДНКазой.
Боковые петли способны к синтезу РНК: включение 3H-уридина происходит практически во всех петлях по всей их длине. Новосинтезированная РНК в петлях быстро ассциирует с белками, заранее синтезированными в цитоплазме.
При изучении ординарных петель на ультратонких срезах было найдено в их составе большое количество гранул 25-40 нм величиной, сходных с интер- и перихроматиновыми гранулами интерфазного ядра и с гранулами в пуфах политенных хромосом.
Более подробно структура боковых петель была изучена в электронном микроскопе на препаратах распластанных диплотенных хромосом.
Оказалось, что общая морфология транскрипции на боковых петлях хромосом типа ламповых щеток удивительно напоминает таковую на рибосомных цистронах (рис. 104). Большинство ординарных боковых петель представляет собой одну транскрипционную единицу, начало транскрипции которой расположено на одном конце петли, а терминальный участок - на другом. Таким образом такая транскрипционная единица тоже имеет форму “елочки”, только изогнутой в виде петли. Здесь также наблюдается линейный градиент транскриптов: короткие в начале, и максимально длинные (до нескольких десятков нм) на концах транскрипционных единиц.
Транскрипты здесь представлены в виде рибонуклеопротеидов. В результате воздействия низких ионных сил они из глобул величиной 25-40 нм превращаются в вытянутые, изогнутые фибриллы, часто на конце имеющие утолщение. Морфология транскриптов на разных петлях неодинаковая. Встречаются расправленные, линейные фибриллы, а также кустистые фибриллы, многократно сложенные сами на себя, вероятно, в результате образования дуплексных структур РНК.
В некоторых петлях может располагаться несколько транскрипционных единиц разной длины, могущих иметь как идентичную, так и оппозитную ориентацию транскрипции (рис. 105). Интенсивность транскрипции также неодинакова на различных петлях: встречаются петли с 30 транскриптами на 1 мкм и с 3-5.
При падении транскрипционной активности в естественных условиях или при экспериментальном подавлении синтеза РНК длина петель уменьшается, они приобретают нуклеосомное строение.
Морфология транскрипции индивидуальных генов
Недавно был предложен более прогрессивный подход для исследования морфологии транскрипции индивидуальных структурных (кодирующих полипептидные цепи) генов. Для этого были использованы ооциты X. laevis, в ядрах которых с помощью микроинъекций можно вводить любые молекулы, в том числе и ДНК. Если же для такого введения взять клонированные гены, то получая препараты по Миллеру, можно обнаружить отдельные от ядрышек и хромосом молекулы ДНК, которые в условиях высокой транскрипционной активности в ядрах ооцитов, в свою очередь вовлекаются в процесс транскрипции. Это и дает возможность наблюдать за транскрипционной активностью индивидуального гена.
Так в ядра ооцитов были инъецированы небольшие циклические молекулы клонированных генов овальбумина кур. Инъекция большого количества этих генов (2-5 нг на ядро) приводили к тому, что в ядре образовывались кластеры из нескольких сот циклических молекул, хорошо отличающихся от элементов собственного хроматина ооцитов. Оказалось, что 80-90% инъецированного материала неактивны. В этом случае индивидуальные циклические молекулы генов были сплошь покрыты нуклеосомами и не содержали транскрипционных комплексов (РНК-полимераза вместе с цепочкой синтезированной РНК).
Небольшая часть инъецированных генов, однако, обладала типичными транскрипционными комплексами. Среди таких активированных генов встречается, по крайней мере, три морфологических класса. В первом случае это были циркулярные молекулы со слабой транскрипцией (3-10 транскриптов на 1 мкм длины хроматина), транскрипты были разной длины и не обладали линейным градиентом. В другом случае наблюдали интенсивно транскрибируемые циклические участки хроматина, покрытые транскрипционными комплексами по всей длине молекулы ДНК (30-50 транскриптов на 1 мкм хроматина). Здесь транскрипты достигали длины до 1,2 мкм. РНК на интенсивно транскрибируемых участках всегда была расположена по градиенту длины, образуя участки, напоминающие “елочки” на транскрипционных единицах ядрышковых ДНК. Первичный транскрипт с клонированного гена овальбумина кур содержит участки кодирующих последовательностей (экзоны) и интроны. На подобных препаратах в тесной ассоциации с нитчатыми транскриптами бывают видны также глобулярные сплайсосомы.
Таким образом, удается наблюдать за работой любых индивидуальных генов.
Синтез транспортных РНК
Гены транспортных РНК относятся к умеренно повторяющимся (10-100) последовательностям в геноме. Они также как р-гены, располагаются тандемно. Длина разных (31 шт.) тРНК колеблется от 74 до 95 нуклеотидов (примерно 30 нм), уложенных в сложную трехмерную фигуру. Отдельный ген тРНК состоит из двух крайних экзонов и одного центрального интрона. Во время процессинга интрон удаляется, а два экзона с помощью фермента лигазы соединяются в зрелую молекулу.