Эффективность

Высокая эффективность колоны обеспечит низкую дисперсию растворов. Один из способов достичь высокой эффективности колоны состоит в том, чтобы использовать хроматографические сорбенты с малым размером частиц (хотя имеются и другие факторы, воздействующие на эффективность колоны). Таким образом, использование малых по размеру частиц уменьшит зазор между зонами раствора, и поможет, если селективность недостаточна, получить разделение, которое требуется. Однако необходимо искать компромисс между высокой стоимостью хроматографических сорбентов и высокими давлениями, которые требуют дорогостоящего оборудования (оно обычно является менее желательным в крупномасштабных facilities). Поэтому, другие средства увеличения разделения, например, увеличение длины колоны или изменение наклона градиента, обычно используются в качестве параметров в процедуре оптимизации.

Разведка (рекогносцировка) метода

Оптимизацию можно выполнять методом «проб и ошибок» или случайной апробацией всех возможных комбинаций параметров, т.е. «методом тыка», что, естественно, приведет к многочисленным экспериментам. Более разумная стратегия состоит в том, чтобы определить критические параметры и диапазон подходящих условий и апробировать этот диапазон для уточнения процедуры. Разведывательная процедура часто основана на более ранних опытах разделения, их пригодности для крупномасштабного производства, наличия хроматографических сорбентов, соответствующих требованиям производства. Например, для облегчения процедуры выбора, одна компания организовала банк данных из 10 хроматографических протоколов. Банк включал ионообменное, гидрофобное взаимодействие и методы гель-фильтрации с вариантами используемых буферных систем. Были исследованы стабильность продукта и отделение от главных примесей при использовании быстродействующих колонок, обеспечивающих короткий по времени анализ. В банке (например, Моно Q) были представлены такие сорбенты, для которых имеется соответствие в сорбентах, применяемых в масштабном производстве (например, Q Sepharose Fast Flow). Эта стратегия не применима ко всем методам хроматографии (например, RPC), где основная матрица имеет явное влияние на разделение. Другие компании предпочитают использовать только те сорбенты в разведывательном процессе, которые применяются в производстве, чтобы получить гарантию при масштабировании и учитывать возможные вариации «от партии к партии» хроматографических сорбентов при исследовании. В любом случае, влияние конфигурации системы на результаты должно быть учтено.

Важно оценить свойства хроматографических сорбентов в условиях приближенным к производству. Такой пример предоставлен в работах по изучению связывающей емкости и «стекания» лиганда с различных протеин-А-содержащих аффинных сорбентов, применяемых для очистки иммуноглобулинов. Отмечено, что данные «стекания» в чистых системах не соответствовали таковым в присутствии иммуноглобулинов.

Неожиданные результаты достаточно часто встречаются в процессе оптимизации и даже при масштабировании. Например, одна группа нашла, что иммобилизованый протеин G, используемый обычно для очистки антител, изменил свои связывающие свойства после повторной регенерации в щелочных условиях: антитела связывались с протеином G более прочно, требуя элюции при более низкой pH, которая вызывала агрегацию и потерю активности антител. Эти результаты были получены в процессе масштабирования и потребовали заново оценить и оптимизировать процесс, что и было выполнено при возврате к маломасштабному исследованию.