MaltsevSciD

О Г Л А В Л Е Н И Е

2.ГЛАВА 2. СКАНИРУЮЩАЯ ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ.

3.ГЛАВА 3. СКАНИРУЮЩАЯ ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ. ТЕОРИЯ

2

3.2.2.Метод тройного двухуглового светорассеяния (Triple Two

3.3.2.Особенности формирования индикатрисы сферической

3.3.3.Особенности формирования индикатрисы частицы

3.3.5.Параметрическое решение обратной задачи светорассеяния

3

4.ГЛАВА 4. СКАНИРУЮЩАЯ ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ.

5.ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ СВЕТОРАССЕИВАЮЩИХ

4

ВВЕДЕНИЕ Дисперсные среды составляют значительную часть окружающей среды,

участвуют и в жизнедеятельности человека, и в различных технологических процессах. Особенно важную роль дисперсные среды играют в биологии и медицине, так как в этом случае носителями дисперсности выступают клетки, микроорганизмы, вирусы и т.п. Естественно, что получение новых знаний о состоянии и развитии дисперсных систем является важной задачей научных исследований. При этом значительную роль в таких исследованиях должны играть современные физические методы, использующие последние достижения в математической обработке данных, в оптических технологиях, вычислительной технике.

Высокой эффективности анализа дисперсных сред можно достичь с использованием оптических методов исследования. Важным преимуществом таких методов является безконтактный способ контроля [1]. Наряду с традиционным оптическим контролем с помощью светового микроскопа, все большое распространение получают методы, использующие всё многообразие эффектов рассеяния света и флуоресценции в дисперсной среде. Существует два подхода к исследованию состава дисперсной среды, а именно: методы, базирующиеся на измерения отклика дисперсной системы как целого и методы, которые изучают отдельные элементы дисперсной среды. Оба подхода имеют свои преимущества и недостатки. Так достаточно легко построить эксперимент по измерению рассеяния света на ансамбле частиц, однако, извлечение полезной информации о дисперсности системы представляется довольно сложной задачей. С другой стороны, экспериментально достаточно сложно изучать отдельные элементы дисперсности, с другой стороны, определить параметры элемента по оптическим измерениям гораздо легче, чем в первом случае. Фактически перед исследователем стоит задача выбора наиболее эффективного способа решения своих задач с использованием одного из этих двух подходов. В данной работе мы рассмотрим в деталях подход, связанный с оптическими исследованиями отдельных элементов дисперсной среды.

Современное состояние теории и эксперимента, связанными с анализом одиночных частиц можно характеризовать следующим: экспериментальные системы, позволяющие измерять свойства одиночных частиц все еще

5

достаточно сложны; теоретические разработки, связанные с определением параметров одиночных частиц, малочисленны и малоэффективны.

В последнее время, в связи с бурным развитием лазерной техники, средств автоматизации измерений и обработки данных и появлением на мировом рынке диагностической аппаратуры, в научных исследованиях и при технологическом контроле получили широкое распространение оптические анализаторы одиночных частиц. Светорассеяние является одним из измеряемых параметров в таких анализаторах.

Наиболее перспективна для анализа одиночных частиц техника проточной цитометрии (см., например, обзоры [2, 3, 4, 5]). Создание и применение проточных цитометрических систем для автоматического анализа и разделения частиц в гидрозолях открыло новые возможности для исследований в области биологии и медицины. Цитометрия в потоке представляет собой большой шаг вперед по сравнению с обычными микроскопическими методами, при использовании которых анализ нескольких частиц занимает несколько часов. В проточных цитометрических системах частицы анализируются со скоростью до 300 тысяч в минуту. Измерение светорассеивающих свойств частиц в таких системах позволяет получать информацию об их морфологических характеристиках (размер, форма, особенности внутренней структуры, коэффициент поглощения и т. п.). Уникальность методики цитометрии в потоке состоит в том, что измерения выполняются на отдельных частицах с большой скоростью. Это обеспечивает высокую статистическую точность и позволяет надежно выявлять малые популяции. При этом анализаторы подобного типа обладают достаточно высокой производительностью (время анализа 2 мин) и надежностью результатов анализа.

Все более жесткие требования предъявляются к времени обработки измеряемых величин светорассеяния на одиночных частицах при одновременном сохранении точности измерений.

Описанные в научной литературе работы, связанные с разработкой методов анализа одиночных частиц, демонстрируют некоторые возможности использования светорассеяния при определении морфологических характеристик одиночных частиц. Однако используемый в большинстве из них метод подгонки теоретических расчетов к экспериментальным результатам

6

требует больших затрат времени и вряд ли найдет широкое применение при высокоскоростном анализе частиц. Поэтому представляется важным дальнейшее совершенствование методов расчета параметров частиц по данным светорассеяния (обратная задача светорассеяния). При этом новые методы должны характеризоваться малым временем оценки параметров (1-10 мс в проточной цитометрии) и достаточной точностью. Особенно широкое распространение такие экспресс-методы могут получить с дальнейшим развитием цитометрических систем при проведении иммуноанализа и анализа элементов крови в медицине [6], при контроле качества продукции сельского хозяйства (например, определении жирности и наличия бактерий в молоке), при экологическом контроле и т. д.

В диссертационной работе:

1. Предложены принципы нового направления, связанного с анализом одиночных частиц по светорассеянию и флуоресценции. Разработаны основы сканирующего проточного цитометра в двух конфигурациях.

2.Предложен цитометр следующего поколения – поляризационный сканирующий проточный цитометр, позволяющий измерять комбинации элементов матрицы рассеяния одиночных частиц.

3.Проведен анализ формирования индикатрисы одиночной частицы. Выявлены основные параметры индикатрисы наиболее чувствительные к изменениям параметров частицы.

4.Введены понятия расстояния между минимумами после граничного угла, переднего и заднего контраста индикатрисы, функции распределения плотности набега фазы частицы, которые используются в разработанном параметрическом решении обратной задачи светорассеяния для одиночных частиц.

5.Продемонстрированы возможности практического использования сканирующей проточной цитометрии при сертификации частиц, при определении параметров биологических частиц.

Разработана оригинальная технология по оптическому детектированию одиночных частиц - Сканирующая проточная цитометрия. Данная технология является существенным шагом вперед по сравнению с существующими

7

методами определения параметров микронных и суб-микронных частиц по светорассеянию. К настоящему времени разработан, создан и испытан уникальный сканирующий проточный цитометр, обладающий в диагностики отдельных клеток возможностями превосходящими проточные цитометры стандартной конфигурации. Проведенная работа в создании новых подходов в проточной цитометрии позволила превзойти достигнутый в мире рубеж.

Практическая ценность настоящей работы определяется использованием результатов при:

-разработке экспресс-методов определения концентрации и параметров частиц в дисперсных средах;

-проведении экспериментальной проверке применимости теоретических разработок для одиночных частиц.

Кроме этого, метод пролетной индикатрисы светорассеяния, базирующийся на сканирующем проточном цитометре, может быть использован для диагностики водных систем, содержащих частицы, при многопараметрическом иммуноанализе, использующем латексные частицы в качестве носителя специфических антигенов.

Диссертация состоит из литературного обзора и четырех глав, каждой из которых предпослан краткий обзор литературы.

Вторая глава диссертации посвящена рассмотрению основных принципов сканирующей проточной цитометрии.

Во втором разделе рассматривается вопросы использования проточного цитометра стандартной конфигурации для измерения латексной агглютинации

иопределения концентрации бактерий и соматических клеток в молоке.

Втретьем разделе дается полное описание работы сканирующего проточного цитометра прямой конфигурации. Рассматривается оптическая функция сканирующей кюветы при измерении индикатрисы одиночной частицы, а так же при времяразрешенном измерении флуоресценции.

Вчетвертом разделе описывается особенности оптической схемы сканирующего проточного цитометра обратной конфигурации.

8

Впятом разделе рассматривается общая схема поляризационного сканирующего проточного цитометра, приводятся расчеты индикатрис рассеяния для несферических частиц.

Вшестом разделе описаны основы электронного управления сбором данных сканирующего проточного цитометра.

Вседьмом разделе обсуждается программное обеспечение сканирующего проточного цитометра.

Третья глава посвящена теоретическим основам светорассеяния на одиночных частицах.

Во втором разделе рассматриваются вопросы решения обратной задачи светорассеяния при работе с цитометром стандартной конфигурации. Представляются метод двухуглового светорассеяния и метод тройного двухуглового светорассеяния.

Третий раздел посвящен индикатрисе одиночной частицы. Представляются приближенные и точные методы расчета индикатрисы. Рассматриваются основы формирования индикатрисы сферической частицы и частицы произвольной формы. Приведено параметрическое решение обратной задачи светорассеяния для сферических частиц и сферических частиц с поглощением. Рассматривается влияние глубины фокусировки падающего луча на индикатрису частицы. Рассматриваются вопросы измерения индикатрисы несферической частицы на сканирующем проточном цитометре на примере сфероида.

Вчетвертом разделе приведены результаты моделирования вращения сфероидальной частицы в пуазейлевском потоке проточного канала цитометра.

Четвертая глава посвящена описанию различных приложений сканирующей проточной цитометрии.

Впервом разделе описаны возможности сканирующего цитометра при сертификации полимерных частиц.

Во втором разделе приводятся данные по использованию сканирующей проточной цитометрии при исследовании дисперсионной полимеризации частиц.

Втретьем разделе рассмотрены вопросы идентификации различных частиц по индикатрисам и исходному сигналу сканирующего проточного цитометра.

9

Вчетвертом разделе представлен метод определения концентрации жира в молоке на базе сканирующей проточной цитометрии.

Впятом разделе приводятся результаты по исследованию светорассеивающих свойств эритроцитов, бактерий E.coli и Salmonella.

Вшестом разделе представлен метод по определению объёма эритроцитов

исодержанию гемоглобина в них с использованием сканирующего проточного цитометра.

Вседьмом разделе приведены результаты использования сканирующей проточной цитометрии при исследовании взаимодействия антиген-антитело на поверхности клеток.

Пятая глава посвящена исследованиям индикатрис рассеяния некоторых типов микроорганизмов на лазерном нефелометре.

В заключении кратко сформулированы основные результаты диссертационной работы.

Основные результаты диссертации представлены в 21 публикации, включенных в прилагаемый перечень. Содержание диссертации докладывалось на Международной конференции “Современные и лазерные технологии” (ALT'92, Москва, 8-11 сентября 1992), Всероссийской конференции по лазерной химии (Лазаревское, 30 сентября - 5 октября, 1992 г), Межреспубликанской конференции "Оптические методы исследования потоков" (Новосибирск, 2-3 июня 1993 г.), Международной конференции “Биомедицинская оптика” (Сан Хосе (США), 4-9 февраля 1995 г.), Межреспубликанском симпозиуме “Оптика атмосферы и океана” (Томск, 20-23 июня 1995 г.), на XVIII конгрессе международного общества по аналитической цитологии. Римини, Италия, 15-18 апреля 1996 г. на конференции по электромагнитизму и светорассеянию: теория и приложения, 27-28 мая 1997, Москва, Россия, на конференции по светорассеянию несферическими частицами, 9-11 июня 1997, Хельсинки, Финляндия, на 7-ом европейском симпозиуме по характеризации частиц, 10-12 марта 1998, Нюрнберг, Германия, а также на научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН (Новосибирск, 1992-2000 гг.), в институтах Сибирского отделения Российской академии наук (1999 г.), в Биомедицинском центре университета г. Упсала (Швеция, 1993 г.), на

10