MaltsevSciD

Рис. 4.16. Модель нормального человеческого эритроцита.

171

z2=(0.86)2(1-x2)(0.01384083+0.2842917x2+0.01306932x4). (4.3)

Это уравнение описывает профиль эритроцита в сечении y = 0, где x, y, z – декартовы координаты. Типичный объём эритроцита равен 85 мкм3, что соответствует длине 6.5 мкм для длинной оси и размеру перетяжки 1.3 мкм. Реальная часть показателя преломления эритроцита для λ = 0.6328 мкм лежит между 1.40 и 1.42 и в основном определяется показателем преломления гемоглобина (1.615) и воды (1.333) [14, 102]. Содержимое эритроцита заключено в тонкую мембрану с толщиной 7 нм. Естественно, что в расчетах мы

волны света, d – характерный размер частицы, m’ и m0 – показатели преломления частицы и среды соответственно. Для эритроцита типичными значениями этих параметров являются 43 и 1.054 соответственно.

Экспериментально мы измерили пробу свежей крови, разбавленную в 100 раз и содержащую приблизительно 106 клеток. Наблюдали очень сильное разнообразие в индикатрисах. Чтобы прояснить ситуацию с многообразием в ВКБ приближении были рассчитаны индикатрисы нормальных эритроцитов в углах от 100 до 350 в зависимости от ориентации эритроцита относительно направления падения излучения. Индикатрисы при различном угле ориентации β приведены на Рис. 4.17. Угол ориентации изменялся от 00 до 900 с шагом 100. В рассчитанных индикатрисах также наблюдалось многообразие. После этого были записаны 443 индикатрисы и некоторые из них показаны на Рис. 4.18.

172

Рис. 4.17. Индикатрисы эритроцита, рассчитанные в ВКБ приближении для различных ориентаций эритроцита относительно направления падающего излучения.

173

Рис. 4.18. Экспериментальные индикатрисы индивидуальных эритроцитов.

174

Для того чтобы легче наблюдать различие в форме индикатрис, они были смещены относительно друг друга на обеих графиках. Наблюдается качественное согласие для индикатрис, измеренных на сканирующем проточном цитометре, и индикатрис, рассчитанных в ВКБ приближении. Однако необходимо отметить существенные отличия. Во-первых, многообразие экспериментальных индикатрис более широко, что вызвано распределением эритроцитов по размеру. Во вторых, индикатриса с наибольшим контрастом среди экспериментальных индикатрис всегда имеет контраст меньший, чем у рассчитанных. Этот факт находится в согласии с вышеприведенными рассуждениями о том, что точная теория дает меньший контраст индикатрисы по сравнению с ВКБ приближением.

К сожалению полный анализ измеренных индикатрис невозможен в настоящее время из-за сложности расчетов для частиц с формой эритроцита. Таким образом извлечь параметры эритроцита по индикатрисам не представляется возможным. Однако можно сделать некоторые предположения об ориентации эритроцитов в зоне регистрации сканирующего проточного цитометра. Отметим, что только индикатрисы с углом ориентации β равном 00, 100, 200 и 300 имеют достаточно ясную и осциллирующую структуру (Рис. 4.17). Контраст этих экспериментальных индикатрис меняется от 0.7 до 0.071. В наших экспериментах контраст 208 индикатрис был больше 0.07, что соответствовало 47% от всех измеренных эритроцитов. Это значение можно представить как нижняя оценка количества контрастных индикатрис, так как ВКБ приближение увеличивает контраст индикатрисы. Большое число индикатрис с осциллирующей структурой находится в противоречии с ожидаемым количеством эритроцитов в определенной ориентации в пуазейлевском потоке, описанным в разделе 3.4. Причина такого противоречия вероятно в эффектах, связанных с гидрофокусировкой частиц. Возможно происходит зарождение «воронки» на входе в капилляр оптической кюветы, что, в свою очередь, вызывает дезориентацию эритроцитов в регистрируемой зоне. По видимому движение эритроцитов в капилляре не стационарно и, поэтому, исходная ориентация эритроцитов на выходе из сопла гидродинамической фокусирующей системы играет важную роль. Все это задает дополнительные требования к

175

проточной системе сканирующего проточного цитометра в случае измерения индикатрис несферических частиц.

4.5.2.Бактерии Escherichia coli и Salmonella typhimurium

Одним из наиболее естественным использованием особенностей сканирующей проточной цитометрии является измерение индикатрис микроорганизмов представляющих практический интерес. Подобно спектру, который характеризует вещество, индикатриса могла бы служить характеристикой того или другого вида бактерий. База данных индикатрис микроорганизмов позволила бы распознавать неизвестные или морфологически модифицированные. Такое распознавание может проводится с использованием современных методов анализа данных, таких как функциональный анализ, корреляционный анализ, с использованием нейронных сетей, параметрический анализ. В дополнение такое распознавание микроорганизмов может быть скомбинировано с одновременным измерением флуоресценции [125], что существенно расширило бы возможности использования сканирующей проточной цитометрии. Для того чтобы начать создание такой базы данных индикатрис, мы должны проанализировать светорассеивающие свойства каждого вида бактерий.

В данном разделе представлены данные по исследованию светорассеивающих свойств наиболее распространенного вида микроорганизмов: Escherichia coli (E.coli). В предыдущие годы светорассеяние E.coli было предметом исследований многих работ. Так индикатрисы взвеси клеток E.coli измерялись на специальном фотометре в углах от 10 до 900 [126]. Для сопоставления экспериментальных данных с теоретическими расчетами использовалось приближение Релея-Ганса, моделируя клетку сфероидом вращения. Положения двух минимумов индикатрисы дали хорошее согласие с теоретическим предсказанием. Проточная цитометрия также использовалась для выявления E.coli в крови [127]. Используя рассеяние вперед и флуоресценцию, можно было посчитать E.coli в крови с одновременным лизисом остальных клеток соответствующими химическими реагентами. Поляризационные свойства рассеянного света суспензией E.coli исследовались

176

Johnston и др. [128]. В результате была измерена фазовая функция индикатрисы в углах 10 - 900, которая обладала характерной для данного вида бактерий структурой. Интенсивно рассеяние на суспензии E.coli изучалось Bronk и др. Они предложили измерять комбинацию элементов матрицы рассеяния, что и было реализовано в угловом интервале 30-1500 [129]. Сравнение светорассеивающих измерений и данных оптической микроскопии обнаружили строгую зависимость положения пика на индикатрисе от диаметра бактерий. Таким образом можно было определить средний диаметр клеток с точностью 20 нм. Данный подход получил дальнейшее развитие с привлечением аппроксимации связанных диполей для теоретического расчета светорассеивающих свойств палочкообразных бактерий [130]. Удалось получить хорошее согласие между рассчитанными и измеренными индикатрисами. Определенный из индикатрис диаметр клеток достаточно точно соответствовал диаметру клеток, измеренному на оптическом микроскопе. Недавно этот подход использовался для изучения роста бактерий [131].

177

В наших экспериментах по исследованию светорассеивающих свойств E.coli мы использовали штамм TG-1 [132]. Данный штамм E.coli поддерживает размножение нитчатого бактериофага M13. Он был получен из коллекции культур клеток Государственного научного центра ВЕКТОР. Бактериальные клетки выращивались при 37°C в бане при энергичном встряхивании.

Выращенные в LB среде (10.0 g NaCl, 10.0 g tryptone "Difco", 5.0 g yeast extract "Difco", pH-7.5) E.coli использовались в экспериментах по светорассеянию без какой-либо дополнительной обработки. Клетки отбирались для эксперимента в различных стадиях роста, которые характеризовались временем развития популяции. Две пробы были использованы – одна в возрасте 50 мин (логарифмическая фаза), а другая в возрасте 1000 мин (стационарная фаза).

Как видно из Рис. 3.30 при несовпадении оси вращения сфероидальной частицы, каковой можно представить E.coli, интегрирование по азимутальному углу должно существенно уменьшать контраст индикатрисы. В наших же экспериментах мы наблюдали 95% индикатрис с большим контрастом, совпадающим по форме с индикатрисами, представленными на Рис. 3.31. Этот факт находится в согласии с данными по ориентации вытянутых частиц в гидрофокусирующих системах [108]. Можно заключить, что в эксперименте абсолютное большинство индикатрис соответствует ориентации частицы, когда ось ее вращения совпадает с осью потока и направлением распространения падающего излучения.

Важной абсолютной характеристикой среди свойств, характеризующих светорассеяние частицы, является дифференциальное сечение рассеяния [75]. В эксперименте измерение абсолютных сечений рассеяния связано с большими трудностями при калибровке оптического и электронного трактов установки. В случае со сканирующим проточным цитометром мы можем воспользоваться тем, что индикатрисы гомогенных сферических частиц с высокой достоверностью совпадают с рассчитанными по теории Ми. Поэтому для определения дифференциального сечения рассеяния клеток E.coli была приготовлена смесь, содержащая бактерии и полистирольные частицы. Результат измерения этой смеси представлен на Рис. 4.19. Указателями на графике отмечены серии индикатрис, соответствующие полистирольным частицам (0.9 мкм и 3 мкм) и клеткам E.coli. Шкала дифференциального сечения

179

рассеяния была установлена из соответствия экспериментальных индикатрис полистирольных частиц и индикатрис, рассчитанных по теории Ми. Таким образом впервые были измерены дифференциальное сечение рассеяния одиночных клеток E.coli. эти данные могут быть использованы как при создании базы данных индикатрис микроорганизмов, а так же при расчете оптических систем, предназначенных для анализа клеток.

Были также проанализированы индикатрисы клеток E.coli, находящихся в различных фазах роста. В частности, были измерены индикатрисы бактерий в логарифмической и стационарной фазах. Результаты измерений представлены на Рис. 4.20 a) и Рис. 4.20 b). Как видно из графиков, основное отличие в индикатрисах для различных фаз роста наблюдается в положении минимума. Соответствующие распределения положения минимума для этих фаз показан на Рис. 4.21.

180