2.Хромосомные: делеции, дупликации, инверсии, транслокации (см. выше);

3.Генные: замены, делеции, дупликации, инверсии, точечные (см. выше).

Для сохранения целостности генетической информации все повреждения ДНК должны быть исправлены (или репарированы). Процесс их восстановления называется репарацией. Все виды репарации можно разделить на 2 основных группы:

1.Прямая репарация;

2.Непрямая репарация.

Прямая репарация осуществляется, как правило, каким-либо одним ферментом. Виды прямой репарации:

1.Фотореактивация — исправление тиминовых димеров ферментами ДНК-фотолиазами (у человека отсутствуют). Коферментами в этой реакции служат N5,N10- метенилтетрагидрофолат и FAD. Тиминовые димеры появляются из-за воздействия на клетку УФ-лучей. Для их репарации также необходим УФ-спектр солнечного света.

2.Деалкилирование — отщепление алкильных групп (метильной, этильной и др.) ферментами алкилтрансферазами. Примеры: поврежденные основания O6-метилгуанин и O6- этилгуанин репарируются O6-алкилгуанин-ДНК- алкилтрансферазами (переносят алкильную группу на один из своих остатков цистеина).

3.Репарация однонитевых разрывов осуществляется ферментами ДНК-лигазами.

4.Репарация АП-сайтов: АП-сайт — нуклеотидный остаток, лишенный азотистого основания (т.е. формально, это уже не нуклеотид, а сахарофосфатная группа). Ферменты инсертазы исправляют такие повреждения, вставляя азотистое основание.

Непрямая репарация осуществляется несколькими ферментами и, как правило, протекает гораздо сложнее — в несколько этапов. Виды непрямой репарации:

1.Эксцизионная репарация оснований (англ. Base excision repair, BER);

2.Эксцизионная репарация нуклеотидов (англ. Nucleotide excision repair, NER);

119

3. Мисметч репарация (англ. Mismatch repair, MMR).

120

зависимый процесс, в котором участвуют ферменты UvrA, UvrB, UvrC. Эту систему ещё часто называют UvrABC-эндонуклеазой.

Стадии репарации:

1.Ферментный комплекс UvrABC разрезает цепь ДНК у 7-го и 3-го/4-го нуклеотида с 5’- и 3’- стороны от повреждения, соответственно.

2.Вырезанный 11-12 нуклеотидный фрагмент затем вытесняется фермен-

том UvrD (хеликаза II).

3.ДНК-полимераза I син-

тезует комплементарную цепочку, а ДНК-лигаза сшивает цепи.

Уэукариот NER-система состоит из 16 белков и вырезает отрезок длиной примерно 30 нуклеотидов.

Рис. 70. Механизм NER-репарации

В ходе репликации ДНК-полимераза может совершать ошибки. Неспаренные нуклеотиды удаляются с помощью мисметч репарации (англ. mismatch — несовпадение). MMR-система способна исправить инсерции и делеции до 4 нуклеотидов. Важность MMR-репарации подчеркивается тем фактом, что у людей с наследственными дефектами этой системы наблюдается повышенная предрасположенность к раковым заболеваниям. Стадии репарации у кишечной палочки E. coli:

1.Белок MutS связывается с некомплементарной парой нуклеотидов.

2.К MutS присоединяется белок MutL.

3.Комплекс MutS2-MutL2 транслорцируется вдоль цепи ДНК таким образом, что формируется петля, замыкающаяся на ком-

плекс MutS2-MutL2.

4.При движении по цепи ДНК комплекс MutS2-MutL2 распознает неметилированную цепочку нуклеотидов GATC и связывается с белком MutH (эндонуклеаза).

5.MutH активируется и разрезает цепь с 5’-конца у неметилированной цепочки GATC (так система распознает новосинтезированную дочернюю цепь ДНК — после синтеза она лишь частично метилирована, а материнская цепь метилирована полностью). Такая неметилированная последовательность GATC мо-

121

жет находиться и в 1000 нуклеотидных остатках от сайта повреждения.

6.Хеликаза UvrD (из NERсистемы) разрывает водородные связи между родительской и дочерней цепями.

7.Экзонуклеаза полностью расщепляет дефектный участок ДНК.

8.ДНК-полимераза III синтези-

рует участок дочерней цепи, комплементарный родительской ДНК.

Учеловека нет гомологов белка MutH, поэтому используется другой механизм распознавания дочерней цепи. По одной из теорий, дочерняя цепь определяется по разрывам между фрагментами Оказаки.

Днунитевые разрывы в ДНК появляются из-за воздействия ионизирующей радиации или свободных радикалов (продуктов окислительного метаболизма). Нерепарированные двунитевые разрывы могут стать летальными для клетки или спровоцировать рак. Существует два основых механизма репарации двунитевых разрывов:

1.Рекомбинационная репарация;

2.Негомологичное соединение концов.

ции, но они не так опасны для клетки, как нерепарированные двунитевые

122

разрывы. В этом виде репарации участвуют белки Ku (димер Ku70 + Ku80). Они присоединяются к ДНК в области малой и большой бороздок и отщепляют несколько нуклеотидных остатков. Затем происходит сшивание цепей. К 70-и годам в соматических клетках человека скапливается до 2000 подобных «шрамов» от негомологичного соединения цепей ДНК.

Агенты, повреждающие ДНК, индуцируют комплексную систему защиты в клетках кишечной палочки E. coli — SOS-ответ. Эта система регулируется белками LexA (репрессор) и RecA (ДНК-связывающий белок). В норме LexA подавляет экспрессию гена SOS. Однако при повреждении цепи ДНК связываются с RecA и формируют комплекс, который выключает LexA. SOS-система контролируется 43 генами, среди которых — гены, кодирующие ДНК-полимеразы IV и V. Эти полимеразы способны синтезировать цепь, не имея матрицы в виде комплементарного участка ДНК. Поэтому SOS-репарация совершает ошибки и является мутагенной, однако позволяет продлить срок жизни клетки. По мнению некоторых учёных, эта система позволяет клеткам приобрести новые признаки, утратив при этом какие-либо другие.

Рекомбинационная репарация у кишечной палочки осуществляется следующим образом:

1.Репликативная вилка встречает одноцепочечный разрыв и останавливается.

2.Процесс восстановления начинается с переноса белками RecBCD + RecA участка новосинтезированной и неповрежденной ДНК на двуцепочечную ДНК в место повреждения (с 3’- конца).

3.Образуется структура Холлидея. Происходит обмен 3’-концами между репликативными вилками с помощью белков RuvAB.

4.Белок RuvC разрывает структуру Холлидея и восстанавливает репликативные вилки.

5.Процесс репликации продолжается при участии особой прай-

мосомы.

Мутация, ДНК гликозилазы, АП-сайт, АП-эндонуклеазы, ДНК фотолиазы, SOS-ответ, рекомбинационное восстановление ДНК, транспозоны.

123

1.Мутации и мутагены. Виды мутаций и механизмы их возникновения.

2.Канцерогенез.

3.Репарация: классификация типов репарации, прямая и непрямая репарация.

4.Эксцизионная репарация:

a.Репарация нуклеотидов (NER);

b.Репарация оснований (BER);

c.Мисметч-репарация (MMR).

5.Рекомбинация как одна из форм репарации.

6.SOS-репарация.



1.Природа точечных мутаций. Транзиции и трансверсии.

2.Инсерции и делеции. Роль интеркалирующих агентов.



1.Характерные черты раковых клеток.

2.Онкогены и гены-супрессоры опухолей.

3.Вирусы, вызывающие появление опухолей. Вирусы как оружие против опухолей.

4.Дефекты в репарирующих системах как фактор развития раковых опухолей.



1.Восстановление ДНК после фотодимеризации (тиминовый димер) — фотореактивация.

2.Деметилирование поврежденных оснований алкилтрансферазами.



1. Репарация оснований (BER):

а. Роль ферментов ДНК-гликозилаз, АП-эндонуклеазы. 2. Репарация нуклеотидов (NER):

а. Роль UvrA, UvrB, UvrC, UvrD эндонуклеаз.

б. Ксеродерма и синдром Коккейна как дефекты NER. 3. Мисметч-репарация (MMR):

а. MutS, MutL, MutH — их роль в мисметч-репарации. 4. Повреждения азотистых оснований: дезаминирование.

124



1.SOS-репарация: роль белков LexA, RecA.

2.Рекомбинационная репарация: роль белков RecBCD, RecA, RuvAB и RuvC. Структура Холлидея.

1.Составьте список природных и химических агентов, повреждающих структуру ДНК.

2.Расскажите о различных видах мутаций.

3.Почему важно проводить анализ канцерогенов на мутагенез?

4.Всегда ли канцероген является мутагеном?

5.Какую функцию выполняют фотолиазы и алкилтрансферазы?

6.Расскажите об эксцизионной репарации:

а. Нуклеотидов (NER);

б. Оснований (BER);

в. Неспаренных оснований (MMR).

7.Какие симптомы появляются при нарушении работы систем NER и MMR?

8.Объясните, зачем клетке такие склонные к ошибкам системы защиты, как SOS-репарация, негомологичное сшивание концов ДНК и полимераза η?

9.Какова роль рекомбинации в исправлении поврежденной ДНК?

10.Как меняется конформация ДНК в ходе рекомбинации?

125

погибают от осмотического шока); также усиливают воспалительный процесс;

г. Эндогенный пироген:

вещества, секретируемые лейкоцитами и другими клетками и вызывающие лихорадку;

д. Естественные киллеры (натуральные киллеры или NKклетки):

уничтожают опухолевые клетки, клетки, пораженные вирусами, а также несовместимые трансплантированные тканевые клетки;

е. Тучные клетки:

выделяют гистамин и другие медиаторы воспаления, а также цитокины, участвующие в специфическом иммунном ответе.

127

При попадании в организм патогенных клеток и/или повреждении тканей происходит каскад событий, приводящих к местному воспалению.

128

Значение воспаления: привлечь фагоциты и белки плазмы в зону повреждения или обнаружения патогена, чтобы:

—Изолировать, уничтожить или инактивировать патогены;

—Удалить отмершие клетки и другой клеточный «мусор»;

—Подготовить ткани к восстановлению.

Рассмотрим сценарий проникновения бактерий в организм в результате местного повреждения кожного покрова:

1.Бактерии попадают в организм через разрывы в кожном покрове. Тканевые макрофаги поглощают патогены и секрети-

руют цитокины и хемотаксины (или хемокины). Внутри фаго-

цитов патогены перевариваются с помощью лизосом и их ферментов. Фрагменты белков этих патогенов «выставляются» на поверхности клеток в комплексе с белками

2.Тучные клетки секретируют гистамин, вызывающий вазодилатацию (расширение просвета сосудов) и расширение капиллярных пор (между клетками эндотелия):

—Увеличение потока крови способствует притоку фагоцитов и плазматических белков в зону повреждения.

—Увеличение капиллярных пор позволяет белкам плазмы, которые в норме не покидают кровяное русло, проникнуть в пораженные ткани. Среди этих белков есть и белки

системы комплемента.

3.Нейтрофилы и моноциты, привлекаемые хемокинами к месту проникновения бактерий, прилипают к эндотелиальным клеткам сосудов, а затем мигрируют через поры между эндотелиальными клетками к месту инфицирования — экстравазация

или диапедез.

4.Моноциты дифференцируются в макрофаги, которые включаются в процесс фагоцитирирования патогенов наряду с нейтрофилами.

5.Приток белков повышает местное интерстициальное осмотическое давление. Приток крови повышает капиллярное кровяное давление. И то, и другое приводит к тому, что вода поступает в ткани и задерживается там. Это явление получило назва-

ние местного отёка:

—Покраснение происходит из-за притока артериальной крови к поврежденным тканям.

—Боль при воспалении связана с местным растяжением тканей и раздражением рецепторов афферентных нейронов химическими веществами, синтезирующимися в этой области.

6.Нейтрофилы и макрофаги выполняют функцию очистки пораженной области от инфекционных, токсических агентов и клеточного «мусора». От накопления токсических продуктов внут-

129

2.Активируется сериновая протеаза MASP-2 (связанная с лектином) и расщепляет белок комплемента C4 на C4a и C4b. Последний связывается с мембраной патогена.

3.C4b связывается с C2, который расщепляется сериновой протеазой MASP-2 на C2a и C2b. Образуется комплекс C4b2a (C4b + C2a).

4.Комплекс C4b2a — это активная C3-конвертаза, расщепляю-

щая C3 на C3a и C3b.

5.Одна молекула C4b2a расщепляет до 1000 молекул C3 до С3b, которые затем связываются с мембраной.

6.C3a стимулирует местное воспаление.

Рис. 74. Активация комплемента по лектиновому пути

Активация фиколинами по лектиновому пути происходит по тому же механизму. Концентрация фиколинов в плазме даже выше, чем у лектина, поэтому они более значимы на практике.

Результат лектинового пути: формируется активный комплекс C4b2a; C3b связывается с мембраной патогена.

Классический путь активации комплемента напоминает лектиновый: он тоже использует «молекулу-сенсор» для узнавания патогенов, но в этом пути эту роль играет комплекс C1 или просто C1. Этот комплекс взаимодействует как с самим патогеном, так и с антителами, поэтому классический путь активации комплемента участвует не только в неспецифическом иммунном ответе, но и в специфическом. Комплекс C1 состоит из большого белка C1q, узнающего патогены, и двух неактивных сериновых протеаз —

C1r и C1s:

Этапы активации:

1.Комплекс C1 связывается с лигандом (патогеном или комплексом антитело + патоген). Активируется C1r, который переводит протеазу C1s в активное состояние: C1 + лиганд → C1r C1s*.

2.C1s расщепляет C4 до C4a и C4b. Последний связывается с мембраной и C2.

3.C1s расщепляет C2 до C2a и C2b. Образуется активный ком-

плекс C4b2a (C4b + C2a).

4.Комплекс C4b2a — это активная C3-конвертаза, расщепляющая C3 на C3a и C3b. C3b связывается с мембраной патогена.

Результат классического пути: формируется активный комплекс C4b2a; C3b связывается с мембраной патогена.

Рис. 76. Активация системы комплемента по классическому пути комплексом антиген-антитело

Этапы активации:

132

1.Белок C3 («си-три» или «це-три») попадает в кровь из печени и время от времени спонтанно активируется (C3*) с помощью гидролиза тиоэфирной связи внутри молекулы.

2.Активированный C3* связывается с фактором B.

3.Фактор D расщепляет фактор B на факторы Ba и Bb.

4.Комплекс C3*Bb представляет собой нестабильную C3конвертазу1, расщепляющую неактивные белки C3 на C3a и C3b. Последний быстро инактивируется, если не контактирует с мембранами патогенов. Однако, если такой контакт происходит, C3b связывается с фактором B, который снова расщепляется фактором D на Ba и Bb (см. Рис. 77.1–Рис. 77.4).

5.Образуется комплекс C3bBb — он является уже стабильной C3конвертазой, расщепляющей неактивные белки C3 на C3a и C3b. С3b быстро покрывают поверхность мембраны патогена. Происходит активация терминальных компонентов компле-

мента (см. раздел 10).

Результат альтернативного пути: формируется активный ком-

плекс C3bBb; C3b связывается с мембраной патогена.

Рис. 77. Активация комплемента по альтернативному пути

Все три пути активации комплемента сходятся на этапе образования C3-конвертазы. Следующим этапом является формирование активной C5-

конвертазы.

1. C5-конвертаза формируется так:

а. В классическом и лектиновом пути C4b2a связывается с

C3b. Образуется C4b2a3b.

б. В альтернативном пути C3bBb связывается с C3b. Образу-

ется C3b2Bb.

Комплексы C4b2a3b и C3b2Bb представляют собой активные

C5-конвертазы.

1C3-конвертаза стабильна лишь некоторое время, однако она стабилизируется белком пропердином (фактор P), который секретируют нейтрофилы в присутствии патогенов.

133

2.C5-конвертаза связывается с белками C5 и расщепляет их на

C5a и C5b.

3.C5b связывается с C6.

4.Комплекс C5b6 (C5b + C6) связывается с C7.

5.Далее происходит последовательное связывание комплекса

C5b67 с белками C8 и C9.

6.Ключевую роль в формировании комплекса мембранной атаки играют 10-16 молекул белка C9. Именно они и образуют мембранную литическую пору.

Рис. 78. Формирование комплекса мембранной атаки

Безусловно, фагоциты должны отличать патогенные клетки от клеток своего организма. Для этого существует два механизма:

1.У фагоцитов на поверхности мембран находятся особые Толлподобные рецепторы. Эти рецепторы «узнают» вещества, содержащиеся в мембранах патогенов — молекулярные особенно-

сти патогена, называемые PAMP (англ. pathogen-associated molecular patterns). Наиболее известными из них являются липополисахариды (ЛПС) грамотрицательных бактерий и пептидогликаны клеточных стенок грамположительных бактерий. Вза-

134

имодействие Толл-подобных рецепторов с патогенами (или чужеродными веществами) стимулирует секрецию фагоцитирующими клетками цитокинов (регуляторных молекул):

а. Привлекают к месту обнаружения патогена другие клетки иммунитета — нейтрофилы и моноциты, а также T- и B-лимфоциты;

б. Активируют другие механизмы врожденного иммуните-

та — фагоцитоз и лихорадку.

2.В организме человека синтезируются особые вещества, «помечающие» патогены для фагоцитирования — опсонины. Важ-

нейшие опсонины — антитела и белки системы комплемента

(например, белки C3b). Опсонины обеспечивают более тесный и надёжный контакт между фагоцитом и патогеном.

Наиболее важные вещества, секретируемые фагоцитами:

1.Макрофаги секретируют оксид азота NO, токсичный для бактериальных клеток.

2.Некоторые секретируемые вещества, например, интерлейкин- 1 2 (IL-1), интерлейкин-6 3 (IL-6), колониестимулирующие факторы4 и фактор некроза опухоли5, усиливают процесс воспаления, оказывая системное дейстие на организм человека. Эти вещества функционируют как эндогенный пироген — вызывают лихорадку. В гипоталамусе происходит выброс проста-

гландинов, которые, действуя локально, провоцируют повышение температуры тела: это ускоряет фагоцитоз и повышает скорость многих ферментативных реакций, связанных с иммунитетом.

Это лишь несколько примеров, отражающих насколько разнообразны и комплексны иммунные ответы при развитии воспаления.

1. Вирус проникает в клетку и реплицируется.

2Интерлейкин-1 вызывает пролиферацию и дифференцировку T-лимфоцитов.

3Интерлейкин-6 вызывает пролиферацию и дифференцировку B- и T-лимфоцитов, отвечающих за продукцию антител и клеточный иммунитет, соответственно.

4Колониестимулирующие факторы стимулируют пролиферацию и дифференцировку нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов и макрофагов.

5Фактор некроза опухоли стимулирует секрецию гистамина тучными клетками. Гистамин вызывают локальную вазодилатацию и повышение сосудистой проницаемости

135

2.Клетка секретирует интерферон — белок, который связывается с рецепторами на пока ещё неинфицированных клетках.

3.Неинфицированные клетки продуцируют неактивные ферменты, способные расщеплять вирусную мРНК и ингибировать синтез белка.

4.Вирус попадает в такую неинфицированную клетку, и ферменты активируются. Репликация вируса блокируется.

Системы врожденного и приобретённого иммунитета тесно взаимосвязаны. Их клетки практически одновременно реагируют на появление антигена в организме, однако их активация — очень сложный многостадийный процесс. Появление приобретенного иммунитета связано с B- и T-

лимфоцитами:

1.B-лимфоциты обеспечивают гуморальный иммунитет, синтезируя и секретируя антитела, специфичные к определенным

антигенам.

2.T-лимфоциты участвуют в клеточном иммунитете, уничтожая инфицированные вирусами клетки (Т-киллеры), а также стимулируют и регулируют иммунные реакции (Т-хелперы и Т- супрессоры).

Т-лимфоциты — это тип лимфоцитов, играющих ключевую роль в клеточном иммунитете: уничтожают опухолевые клетки, клетки, инфицированные вирусами, и трансплантированные клетки. Существует несколько субпопуляций Т-лимфоцитов:

1.Т-хелперы секретируют цитокины, белки и пептиды, стимулирующие и взаимодействующие с другими лейкоцитами, включая другие Т-хелперы.

а. Т-хелперы 1 участвуют в клеточном иммунитете: акти-

вируют макрофагов и Т-киллеры, а также секретируют цитокины.

б. Т-хелперы 2 участвуют в гуморальном иммунитете: ак-

тивируют B-клетки и стимулируют продукцию ими антител.

2.Т-клетки памяти сохраняют аффинность к антигену и участвуют во вторичном иммунному ответе.

3.Регуляторные Т-клетки (ранее Т-супрессоры), как правило,

подавляют иммунную функцию. Эти клетки играют важную роль в ограничении реакций иммунной системы своего организма (подавляют развитие аутоиммунных заболеваний).

136

4.Т-киллеры уничтожают клетки, инфицированные вирусами, и опухолевые клетки.

B-лимфоциты — это тип лимфоцитов, играющих ключевую роль в гуморальном иммунитете: участвуют в «представлении» антигена, образуют и секретируют антитела и отвечают за иммунную память. Существует несколько субпопуляций B-лимфоцитов:

1.Плазматические клетки продуцируют и секретируют антитела, которые «помечают» клетки для уничтожения фагоцитами и активируют систему комплемента (комплекс мембранной атаки).

2.B-клетки памяти способны долгое время существовать в организме и обеспечивать быстрое реагирование на повторное появление антигена в организме.

3.B-2 клетки («наивные» B-клетки) представляют собой недифференцированные неактивные B-лимфоциты.

4.Регуляторные B-клетки участвуют в иммунной регуляции,

секретируя интерлейкин-10 (IL-10) и трансформирующий ростовой фактор-бета (TGF-beta).

Антитела — это белки,

которые синтезируются B- лимфоцитами и плазматическими клетками в ответ на появление антигена. Они представляют собой молекулы в форме буквы «Y», состоящие из 4 полипептидных цепей: две идентичные тяжелые цепи и две идентичные лёгкие цепи. Существует два основных типа лёгких цепей: κ (каппа) и λ (лямбда).

Каждая цепь имеет кон-

стантный и вариабельный фрагмент (или участок) (см. Рис. 80). Вариабельные фраг-

менты отвечают за связывание строго определённого антигена. Отчасти это напоминает

модель взаимодействия фермента с субстратом «ключ-замок». Констант-

137

ный фрагмент — активирует систему комплемента по классическому пути (комплекс мембранной атаки) и связываются с макрофагами, базофилами

итучными клетками, выступая в роли опсонинов (см. Тему 9.11).

Врамках молекулы антитела выделяют:

1.Fab-фрагмент (англ. Fragment antigen binding) — этот фраг-

мент отвечает за связывание с антигеном;

2.Fc-фрагмент (англ. Fragment crystallizable) — этот фрагмент отвечает за активацию системы комплемента и связывание с

клетками иммунной системы (см. Ошибка! Источник ссылки е найден.).

Антитела составляют большой процент белков плазмы. Их ещё называют γ-глобулинами (гамма) или иммуноглобулинами. Выделяют 5

классов антител:

138

гут взаимодействовать с такой клеткой и не узнаются ею. Такое разнообразие антител должно каким-то образом синтезироваться в организме.

Ранее ученые считали, что всё многообразие антител образуется при попадании антигена в организм. В настоящее время учёными признана

теория клональной селекции. Положения этой теории: 1. Разнообразие антител:

а. Стволовые B-клетки дифференцируются в костном мозге и становятся B-лимфоцитами, каждый из которых продуцирует разные антитела, способные узнавать разные антигены. Эти антитела затем выставляются на поверхности B-лимфоцитов.

б. Связывание антигена с одним из таких антител на поверхности клетки стимулирует деление этой клетки и генерацию клона — клетки с идентичной генетической информацией. Этот первичный иммунный ответ часто подкрепляется участием особых клеток — Т-хелперов. Они передают на B-лимфоцит сигнал в виде белка — интер- лейкина-2. Он стимулирует деление B-лимфоцитов и их дифференцировку в плазматические клетки и B-клетки памяти.

в. Плазматические клетки продуцируют антитела с очень высокой скоростью (до 2000 молекул в секунду). Эти антитела секретируют в крови и обеспечивают гуморальный иммунитет. Эти антитела имеют те же антигенсвязывающие сайты, что и те поверхностные антитела на поверхности B-лимфоцитов, которые прошли много стадий деления и дифференцировки. Однако у них отсутствует гидрофобный домен, закреплявший их в мембране B- лимфоцита. Клетки памяти обеспечивают иммунную память и продолжают циркулировать в крови длительное время. При повторном попадании антигена в организм они участвуют во вторичном иммунном ответе.

2.Отсутствие иммунных реакций на белки и ткани своего ор-

ганизма: нам не удаётся обнаружить клоны B-лимфоцитов, продуцирующие антитела к белкам и клеткам своего организма, поскольку незрелые B-лимфоциты плода, встречающие ка- кие-либо вещества в формирующемся организме, не стимулируются к делению. Такие клетки уничтожаются ещё до рождения. Остаются лишь те, которые продуцируют антитела ко всему чужеродному.

3.Аутоиммунные реакции: иногда во взрослом организме происходят аутоиммунные реакции, когда B-клетки начинают вдруг продуцировать антитела к нормальным тканям организ-

140

ма. Причины этому не всегда понятны, однако последствия таких реакций могут быть крайне тяжёлыми.

Антитела, а именно их тяжелые и легкие цепи, кодируются множеством генов, которые расположены на разных хромосомах. Эти гены подвергаются соматической рекомбинации. Об этом первыми заговорили японские ученые Хоцуми и Тонегава в 1976 году. Рекомбинация генов антител происходит только в соматических клетках и не наследуется (именно поэтому соматическая). Локусы генов, кодирующих вариабельные фрагменты лёгкой и тяжёлой цепей, содержат множество сегментов, которые и подвергаются соматической рекомбинации. Результатом этой рекомбинации является зрелый V-экзон, кодирующий вариабельную цепь.

1.Сегменты вариабельного гена, кодирующего тяжелую цепь: VH

(variable), DH (diversity) и JH (joining).

2.Сегменты вариабельного гена, кодирующего лёгкую цепь: Vκ

(variable) и Jκ (joining), Vλ (variable) и Jλ (joining).

По некоторым оценкам, в геноме человека существует:

—50 функциональных VH генов, 27 DH генов и 6 JH генов.

—33-36 функциональных Vλ генов, 5 функциональных Jλ генов, 34-40 функциональных Vκ генов, 5 функциональных Jκ генов.

Соединение этих сегментов ещё называют V(D)J-рекомбинацией, а разнообразие, создаваемое с помощью неё — комбинаторным.. Зрелый экзон лёгкой цепи состоит из одной связки V-J. Экзон тяжёлой цепи формируется путем связывания D-сегмента с J-сегментом, а только потом с ними связывается V-сегмент. Реорганизованная ДНК транскрибируется, транскрипт РНК сплайсируется таким образом, чтобы сблизить экзоны V- фрагмента (вариабельного) и C-фрагмента (константного). Затем сплайсированная мРНК транслируется на готовый белок-антитело. Дополнительное разнообразие создаётся путем соединения тяжёлых цепей с κ- и λ- лёгкими цепями. Попробуем посчитать, какое количество антител можно закодировать так:

—Общее число возможных тяжелых цепей:

50 VH × 27 DH × 6 JH = 8.1 × 103.

—Общее число возможных лёгких цепей:

33 Vλ × 5 Jλ + 40 Vκ × 5 Jκ = 165 + 200 = 365.

—Теперь оценим число возможных комбинаций тяжелых и лёгких цепей: 3 × 106.

—Дополнительное многообразие формируется за счет сегмент-

ной рекомбинации и соматической гипермутации.

Соматические гипермутации представляют собой точечные мутации и происходят в B-клетках, которые стремительно проходят множество стадий деления в герминативных центрах лимфоидных фолликулов. Частота таких мутаций — 1 × 10–3 на один нуклеотид в одном цикле деления, что в 106 раз больше, чем частота мутаций в обычных клеточных генах.

Итак, разнообразие антител объясняется следующими механизмами:

141

1.Комбинаторное соединение сегментов генов;

2.Связывание цепей: после стандартной V(D)J-рекомбинации неиспользуемые сегменты удаляются, это приводит к появлению двунитевых разрывов между сегментами. Эти разрывы должны быть закрыты. Часто это требует удаления или вставки нуклеотидов, что и формирует многообразие;

3.Комбинаторное соединение тяжелой и лёгкой цепей;

4.Соматическая гипермутация в V-областях.

Первичный иммунный ответ заключается в том, что недифференцированные B-лимфоциты («наивные» B-клетки), встречаясь с антигеном, активируются и проходят стадии деления и дифференцировки в плазма-

тические клетки и B-клетки памяти. Затем плазматические клетки про-

дуцируют антитела, которые способствуют эффективному уничтожению антигена в организме. B-клетки памяти сохраняются в крови и участвуют во вторичном иммунном ответе. В целом, от момента встречи B- лимфоцита с антигеном до продукции достаточного количества антител плазматическими клетками проходит 3-14 дней. При этом у пациента развиваются симптомы заболевания, поскольку антигену удаётся вызвать повреждение тканей.

Вторичный иммунный ответ обеспечивается B-клетками памяти, когда антиген, вызвавший первичный иммунный ответ, снова попадает в организм. Клетки памяти начинают быстро делиться и формировать плазматические клетки, а те, в свою очередь, продуцируют антитела к данному антигену, и его удаётся быстро уничтожить. Обычно вторичный иммунный ответ занимает от нескольких часов до нескольких дней и протекает гораздо быстрее первичного.

Теперь рассмотрим подробно процессы, происходящие в рамках гуморального иммунитета. Итак, все антигены можно разделить на:

—Тимус-зависимые антигены (требуют участия Т-хелперов): большинство антигенов;

—Тимус-независимые антигены (не нуждаются в Т-хелперах):

бактериальные полисахариды, липополисахариды, высокопо-

лимерные белки.

Соответственно, выделяют два пути активации B-лимфоцитов: ти-

мус-зависимый и тимус-независимый путь. Оба пути требуют передачи

двух сигналов на B-лимфоцит:

142

—Тимус-зависимый: сигнал 1 (от взаимодействия антигена с мембранными антителами B-лимфоцитов IgM и IgD) и сигнал 2 (от взаимодействия CD40-белка B-лимфоцита и CD-40L- лиганда Т-хелпера).

—Тимус-независимый: сигнал 1 (от взаимодействия антигена с мембранными антителами B-лимфоцитов IgM и IgD) и сигнал 2 (от взаимодействия Толл-подобного рецептора B-лимфоцита и другого фрагмента антигена, например, липополисахаридов

бактерий или бактериальной ДНК).

Рассмотрим подробно тимус-зависимый путь активации B- лимфоцитов (см. Рис. 81).

1.Представление антигена:

—Антиген, попадая в организм, «узнается» и поглощается

антигенпредставляющими клетками (АПК) — B-

лимфоцитами, макрофагами и дендритными клетками. В узнавании антигенов участвуют Толл-подобные рецепто-

ры и B-клеточные рецепторы (BCR, только у B-

лимфоцитов).

В нашем случае антиген взаимодействует с мембранными иммуноглобулинами IgM и IgD B-лимфоцита — так передаётся сигнал 1.

—Внутри B-лимфоцита (или другой АПК) вакуоль с патогеном сливается с лизосомами и подвергается переварива-

нию, а фрагменты белков патогена «выставляются» на поверхности этих клеток в комплексе с белками MHC клас-

са II (англ. MHC, major histocompatibility complex — глав-

ный комплекс гистосовместимости). Это явление получи-

ло название «представления» антигена.

—B-лимфоцит (или другая АПК) мигрирует в лимфатические узлы. С ним встречаются «наивные» (недифференцированные) Т-хелперы. На поверхности Т-хелперов нахо-

дится комплекс Т-клеточного рецептора (TCR) и CD3-

маркера, который взаимодействует с комплексом фрагмента антигена и белков MHC класса II на поверхности АПК.

—Взаимодействие этих двух комплексов запускает сложный каскад внутриклеточных сигнальных путей. Сближение АПК и Т-хелпера обеспечивается специфическими белками: интегринами LFA-1 (Т-клетки) и ICAM (АПК).

2.Проверка антигена:

—После передачи сигнала на Т-хелпер наступает следующая фаза представления антигена — проверка. Т-хелпер должен быть «уверен» в том, что ему был представлен именно чужеродный антиген. Это обеспечивается взаимодей-

143

ствием особых белков CD28 (на поверхности Т-хелпера) и СD80/CD86 (на поверхности АПК).

3.Пролиферация:

—Как только вторая стадия пройдена, Т-хелперы секретируют интерлейкин-2 (и рецептор к нему — CD25 или ин- терлейкин-2R) во внеклеточное пространство, который сразу же действует на секретировавшую его клетку (аутокринный механизм). Кроме того, интерлейкин-2 воздействует на соседние клетки Т-хелперов, вызывая их пролиферацию.

—Клетки, активированные таким образом, становятся Т-

хелперами 0 и секретируют интерлейкин-2, интерлей- кин-4 и интерферон γ (ИФН-гамма).

—Затем Т-хелперы 0 дифференцируются в Т-хелперы 1 или Т-хелперы 2 в зависимости от цитокинов, которые воздействуют на них.

—Интерферон γ стимулирует продукцию Т-хелперов 1, а ин- терлейкин-4 и интерлейкин-10 ингибируют её.

—Интерлейкин-4 стимулирует продукцию Т-хелперов 2, а интерферон γ ингибирует её.

4.Взросление:

—Пройдя много циклов деления, предшественники Т- хелперов дифференцируются в эффекторные Т-хелперы,

Т-хелперы памяти и регуляторные Т-хелперы.

144

Опсонизацию — «помечают» антигены для фагоцитирования;

Активацию комплемента по классическому пути

(см. Тему 9.8).

—B-клетки памяти продолжают циркулировать в кровяном русле. Участвуют во вторичном иммунном ответе и способны быстро реагировать на повторное появление антигена в организме.

Клеточный иммунитет обеспечивается цитотоксическими Т- клетками (Т-киллерами) и служит для уничтожения патогенов, находящихся внутри клеток организма: всех вирусов, некоторых бактерий, грибов и паразитов. Кроме того, клеточный иммунитет участвует в ряде аллергических реакций, в борьбе с опухолями и отторжении трансплантированных клеток.

После попадания в клетку вирус запускает процесс собственной репликации. Затем новые вирусные частицы покидают клетку и заражают другие. Находясь внутри клетки, вирусам удаётся избежать гуморального иммунитета и действия антител. Чтобы остановить репликацию вируса, необходимо уничтожить клетку, в которую ему удалось проникнуть. На первой стадии заражения инфицированные клетки обнаруживаются и уничтожаются естественными киллерами (NK-клетками). Тем временем происходит активация и деление Т-киллеров, которые способны с бо́льшеи эффективностью уничтожать инфицированные клетки.

1.Дендритные клетки, самые эффективные АПК, поглощают вирусную частицу или становятся её «жертвой» (см. Рис. 82).

2.Происходит переваривание вирусной частицы (антигена) и «презентация» фрагмента антигена на поверхности дендритной клетки в комплексе с белками MHC класса I. С этим комплексом взаимодействует Т-киллер с помощью своего Т- клеточного рецептора и белка CD8. Помимо этого, белок B7 дендритной клетки взаимодействует с белком CD28 Т-киллера.

3.Почти одновременно с этим комплекс фрагмента антигена и белков MHC класса II на поверхности дендритной клетки взаимодействует с Т-клеточным рецептором и белком CD4 Т- хелпера.

4.Т-хелпер начинает секретировать интерлейкин-2, интерлей- кин-10, γ-интерферон (запускает свою же продукцию и секре-

цию другими Т-хелперами) и трансформирующий фактор ро-

ста-β. Интерлейкин-2 по паракринному механизму воздействует на Т-киллер. Сам Т-киллер тоже выделяет интерлейкин-2, который сразу же воздействует на саму выделившую его клетку

(аутокринный механизм).

146

5.Т-киллеры проходят много циклов клеточного деления и диф-

ференцируются в зрелые Т-киллеры и Т-клетки памяти

(участвуют во вторичном иммунном ответе).

6.Почти все клетки организма экспрессируют на своей поверхности белки MHC класса I. Если вирусу удалось проникнуть в клетку, то фрагменты его белков будут «выставлены» на поверхности клетки в комплексе с белками MHC класса I. Зрелый Т-киллер взаимодействует с этим комплексом с помощью Т- клеточного рецептора и белка CD8. У здоровых клеток организма в мембране нет антигенов в комплексе с белками MHC класса I, поэтому Т-киллеры на них не реагируют, однако стоит фрагменту антигена появиться на мембране клетки, как Т- киллер активируется и секретирует перфорины и гранзимы.

а. Перфорин, по структуре напоминающий белок комплемента C9, образует в мембране клетки литическую пору.

б. Гранзимы проникают в клетку через образованные каналы и запускают апоптоз.

Если вириону удаётся «выйти» из клетки через поры до апоптоза, он становится мишенью фагоцитарных клеток и гуморального иммунитета (встречается с антителами, специфичными к нему, если соответствующие специфичные к нему популяции плазматических клеток и B-клеток памяти уже существуют).

147

Кроме этого, в организме человека продуцируются антитела (агглютинины) к этим антигенам:

1.У людей с группой крови A (II) продуцируются анти-B-

антитела;

2.У людей с группой B (III) — анти-A- антитела;

3.С группой AB (IV) антитела не продуцируются вовсе.

4.Наконец люди с группой крови 0 (I) имеют как анти-A-, так и

анти-B-антитела в крови.

Логично предположить, что эти антитела начинают вырабатываться после переливания чужой крови. Однако у людей, которым никогда не делали переливания крови, эти антитела тоже обнаруживаются. Ученым удалось разрешить эту проблему: оказывается, что ещё на первом году жизни организм младенца реагирует на A- и B-подобные антигены безвредной кишечной микрофлоры. В соответствии с группой крови к ним вырабатываются антитела (описано выше). Причем если на поверхности эритроцитов присутствуют А-антигены, то анти-А-антитела не вырабатываются. Вместо них, вырабатываются анти-В-антитела. И так далее.

Если человеку перелить кровь, группа которой несовместима с его собственной, антитела вступят во взаимодействие с антигенами. К настоящему моменту известно, что самые негативные последствия происходят из-за действия антител в плазме реципиента на эритроциты донора. Действие донорских антител на эритроциты реципиента менее значимо, если объём переливаемой крови невелик. Это происходит из-за того, что незначительное количество антител в переливаемой крови не способно вызвать повреждение эритроцитов.

Действие антител на эритроцитарные антигены может привести к агглютинации (склеиванию) или гемолизу (разрушению эритроцитов). Агглютинация и гемолиз донорских эритроцитов антителами реципиента может привести к летальной трансфузионной реакции. Агглютинированные эритроциты могут закупорить кровеносные сосуды. Но самая большая опасность заключается в том, что разрушение эритроцитов и выход гемоглобина в кровь может привести к острой почечной недостаточности, поскольку способен осаждаться в почках и блокировать мочеформирующие структуры.

Поскольку у людей с 0 (I) группой крови антигены на эритроцитах отсутствуют, их эритроциты не будут атакованы анти-А- и анти-B- антителами. Они считаются универсальными донорами. Их кровь можно переливать людям с любой группой. Однако им самим можно переливать

149

лишь кровь той же 0 (I) группы, поскольку анти-А- и анти-B-антитела, содержащиеся в их плазме будут атаковать эритроциты, несущие эти антигены на своей мембране.

Люди с IV (AB) группой крови считаются универсальными реципиентами, поскольку в их крови отсутствуют анти-A- и анти-B-антитела. Однако сами они могут быть донорами лишь для людей с той же IV (AB) группой, поскольку их эритроциты несут на своей мембране A- и B- антигены, а значит, будут атакованы антителами реципиента.

Термины универсальный донор и реципиент не совсем корректны, поскольку другие эритроцитарные антигены и антитела могут вызвать трансфузионные реакции. Важнейший из них — резус-фактор.

Резус-фактор — эритроцитарный антиген (белок), впервые обнаруженные у макак-резус (отсюда и его название). Людей, у которых он обнаруживается, называют резус-положительными (Rh+). Соответственно, тех, у кого его нет, резус-отрицательными (Rh–). Антитела к резусу вырабатываются только у резус-отрицательных людей, поскольку для них этот белок является чужеродным. Таким людям необходимо переливать только резус-отрицательную кровь. Резус-конфликт может возникнуть между ре- зус-отрицательной матерью и резус-положительным плодом. В этом слу-

чае может развиться гемолитическая болезнь новорождённых: антитела матери вызывают гемолиз эритроцитов плода.

Врожденный и приобретенный иммунитет, антиген, антитело, эпитоп, главный комплекс гистосовместимости, антигенпредставляющие клетки, лимфоциты, цитокины,

1.Сущность иммунитета. Виды иммунитета. Компоненты иммунной системы.

2.Сущность гуморального и клеточного иммунитета.

3.Гипотеза гаметных клонов (клонально-селекционная теория). Гипотеза соматического изменения генома. Индукция разнообразия антител.

4.Строение и механизм функционирования антител.

5.T- и B-лимфоциты.

6.Группы крови. Правила переливания крови.

150



1.Основные понятия иммунологии.

2.Общая характеристика и особенности врожденного иммунитета как первой линии защиты нашего организма.

3.Индуцированные реакции врожденного иммунитета:

а. Воспаление; б. Интерфероны;

в. Натуральные киллеры; г. Система комплемента.

4.Клетки, обеспечивающие врожденный иммунитет: натуральные киллеры, дендритные клетки, макрофаги.



1.Клеточный иммунитет.

2.Гуморальный иммунитет.

3.Антигенпрезентирующие клетки (АПК).

4.Популяции T-лимфоцитов: а. T-киллеры;

б. Т-хелперы; в. Регуляторные Т-лимфоциты (ранее их называли Т-

супрессоры).

5.B-лимфоциты.

6.Активный и пассивный иммунитет.



1.Первичные и вторичные лимфоидные органы.

2.Главный комплекс гистосовместимости: I и II.

3.Система комплемента и пути активации: классический, альтернативный и лектиновый.



1.Сбои иммунной системы.

2.Аллергия и аллергические заболевания.

3.Аутоиммунитет и трансплантация.

4.Управление иммунными ответами.

5.Рак.

6.СПИД.



1. Классы антител.

151

2.Строение антител.

3.Поли- и моноклональные антитела.

1.Как функционирует иммунная система?

2.Какую роль играют T- и B-клетки?

3.Что такое антитела? Какие фрагменты антител отвечают за связывание антигена и выполняют эффекторную функцию?

4.Расскажите о механизмах, обеспечивающих многообразие антител.

5.Какую роль играет главный комплекс гистосовместимости?

6.Что такое опсонизация? Какие молекулы выступают в роли опсонинов в организме человека?

7.Как происходит представление антигена? Какие клетки являются антигенпредставляющими?

8.Расскажите об иммунной памяти.

9.Расскажите о системе AB0.

10.Что такое резус-фактор?

152

—Модель предполагает, что все мембраны идентичны, а это не так.

—Белки мембран взаимодействуют с водной фазой на обеих поверхностях мембраны, а такая конфигурация нестабильна.

Внастоящее время принята жидкостно-мозаичная модель строения мембран (её предложили Джонатан Зингер и Гарт Николсон). Её положения:

1.Мембрана — «жидкая мозаика» фосфолипидов и белков.

2.Существует две основные категории мембранных белков:

—Периферические белки;

—Интегральные белки.

3.Мембраны асимметричны по составу:

—Снаружи и изнутри с мембранами связаны разные периферические белки;

—Внешний и внутренний липидный слои имеют разный липидный состав;

—Некоторые белки пронизывают мембрану насквозь; они называются интегральными;

—Липидный бислой текуч и обеспечивает латеральную диффузию белков и самих липидов.

—Липиды способны и к

Липидную основу всех биомембран составляют 3 класса липидов: 1. Фосфолипиды:

а. Глицерофосфолипиды (или фосфоглицериды) состоят из

глицерол-3-фосфата, C1 и С2 атомы которого связаны с жирными кислотами, а с C3 атомом обычно связан остаток фосфорной кислоты и полярная группа X (см. Таблица

1).

Рис. 83. Общая структурная формула фосфоглицерида

Таблица 1. Глицерофосфолипиды

154

Фосфатидилхолин

Фосфатидилэтаноламин

Фосфатидилсерин

Фосфатидилглицерол

Дифосфатидилглицерол (кардиолипин)

Фосфатидилинозитол

б. Сфингофосфолипиды (или сфингомиелины) состоят из

церамида (аминоспирт сфингозин + жирная кислота, связанная с аминогруппой сфингозина с помощью амидной связи) и полярной головки — фосфохолин или фосфо- этаноламин (связаны с основной гидроксильной группой сфингозина) (см. Рис. 84).

Рис. 84. Структурные формулы сфингозина и церамида (справа).

в. Плазмалогены состоят из глицерола, у которого C1 атом связан с ацильной группой α,β-ненасыщенной связью (см.

Рис. 85).

155

—Контролирует текучесть биомембран, взаимодействуя с полярными головками фосфо- и сфинголипидов. Это взаимодействие повышает мембранную упаковку и снижает текучесть. А это, в свою очередь, уменьшает проницаемость мембран для нейтральных соединений, ионов H+ и Na+.

—Участвует в кавеолярном и клатрин-зависимом эндоцитозе.

—Является мембранным антиоксидантом.

б. Фитостеролы (у растений — эрго- и ситостерол).

Рис. 86. Плазматическая мембрана

Все мембранные белки можно разделить на 4 группы:

1.Интегральные политопические белки прочно связаны с мем-

браной с помощью гидрофобных взаимодействий и пронизывают её насквозь. При этом интегральные белки амфифильны, т.е. имеют как гидрофобные участки, погружённые в мембрану, так и гидрофильные, обращённые к водой среде. Некоторые белки содержат липидные группы, заякоривающие их в мембране: пренильные группы, ацильные группы (жирные кислоты) и гликозилфосфатидилинозитол.

Примеры интегральных политопических белков: транспортеры (АТФазы), ионные каналы (аквапорины, хлоридные каналы), портеры (унипортеры, симпортеры, антипортеры), некоторые ферменты (метанмонооксигеназа, ромбоидпротеаза).

157

2.Интегральные монотопические белки прочно связаны лишь с одним слоем липидов мембраны и не пронизывают её насквозь

(другое название — полуинтегральные).

Примеры интегральных монотопических белков: простаглан-

дин H2 синтаза 1 и 2 (циклооксигеназы), ланостеролсинтаза и скваленциклаза, микросомальная простагландин E синтаза, карнитин-O-пальмитоилтрансфераза-2.

3.Периферические белки ассоциированы с поверхностью мембран с помощью ионных и водородных связей с липидами и интегральными белками.

Примеры периферических белков: цитохром c (связанный со внешней поверхностью внутренней митохондриальной мем-

браны), липоксигеназы, холестеролоксидазы, каротиноидоксигеназы, фосфолипаза С, фосфолипаза А2, сфингомиелиназа С.

4.Амфитропические белки обнаруживаются как в свободном виде в цитозоле, так и в связанном виде с мембранами. Их аффинность к мембранам обусловлена нековалентными взаимодействиями с мембранными белками и липидами, а в других случаях — наличием липидных групп.

Примеры амфитропических белков: Src-киназы (нерецепторные тирозиновые киназы), фосфолипиза С (участвующая в инозитолфосфатном сигнальном пути), цитидилтрансфераза, про-

теинкиназа С, винкулин (белок цитоскелета).

1.Формирование физиологического клеточного барьера и отделение клеточного содержимого (образование мембранных органелл), поддержание его постоянства.

2.Транспорт веществ:

а. Пассивный; б. Активный.

3.Коммуникация между клетками и внутриклеточная сигнализация (сигнальные пути).

4.Клеточная адгезия.

5.Участие в энергетических процессах и проведении нервных импульсов.

Мембранный транспорт может быть:

1.Неопосредованным (простая диффузия) — так переносятся неполярные соединения (преимущественно — газы), белки в этом процессе не участвуют;

158

2.Опосредованным — так транспортируются полярные соединения и происходит это с помощью белков-переносчиков:

а. Пассивно-опосредованный транспорт (пассивный транспорт);

б. Активно-опосредованный транспорт (активный транс-

порт).

—Первично-активный транспорт.

—Вторично-активный транспорт.

Пассивный транспорт происходит по градиенту концентрации (из места с повышенной концентрацией вещества в место с его пониженной). Его осуществляют:

1.Ионофоры: переносят ионы или формируют каналы (валиномицин, переносящий ионы K+);

2.Ионные каналы: переносят ионы и могут быть высокоселективными;

3.Порины: переносят ионы или неполярные вещества (бактериальный белок мальтопорин, переносящий мальтодекстрины);

4.Транспортные белки: отвечают за унипорт, симпорт и антипорт;

5.Аквапорины: осуществляют трансмембранный перенос молекул воды.

Активный транспорт происходит против градиента концентрации с затратой энергии по двум механизмам: первично-активному и вторичноактивному.

В большинстве случаев первично-активный транспорт сопряжён с гидролизом АТФ (дефосфорилированием — отщеплением остатка фосфорной кислоты), что обеспечивает энергию для транспорта против градиента концентрации. Первично-активный транспорт осуществляется АТФ-зависимыми транспортерами:

1.АТФазы типов «P», «F», «V», «A»: переносят H+, Na+, K+, Ca2+, и

другие ионы. Пример: (Na+–K+)-АТФаза, Ca2+-АТФаза;

2.ABC-транспортеры: переносят ионы, небольшие молекулы метаболитов и лекарственных веществ. Пример: P-гликопротеин.

Вторично-активный транспорт использует энергию электрохимического градиента (градиента концентрации ионов), которая обеспечивается с помощью первично-активного транспорта. Иными словами, не используя энергию АТФ напрямую, вторично-активный транспорт зависит от первично-активного, а значит, косвенно нуждается в энергии АТФ. Примеры: Na+-глюкозная транспортная система (в энтероцитах), лактозная пермеаза (у кишечной палочки E. coli).

Пассивный и активный транспорт может осуществляться по трем механизмам:

1.Унипорту (один ион/молекула в одном направлении);

2.Симпорту (два иона в одном направлении);

159

3. Антипорту (два иона в разных направлениях).

Рис. 87. Транслоказные системы и механизмы транспорта: унипорт, симпорт и антипорт

Помимо небольших молекул и ионов клеткам необходимо поглощать и экспортировать частицы и крупные молекулы, которые не могут быть перенесены в клетку или из неё с помощью пассивного и активного транспорта. Для этого существует везикулярный транспорт в клетку (эндоци-

тоз) и из клетки (экзоцитоз).

Эндоцитоз — это процесс захвата макромолекул плазматической мембраной и транспорта их в клетку путем образования липидной везикулы. Пути эндоцитоза:

1.Клатрин-зависимый эндоцитоз осуществляется путём обра-

зования небольших везикул (100 нм в диаметре), покрытых белковой оболочкой, состоящей из комплекса разных белков с белком клатрином. Так захватываются: ЛПНП, трансферрин, ростовые факторы и антитела. В этом пути участвуют мембранные рецепторы.

2.Кавеолярный эндоцитоз осуществляется с помощью мембранных впячиваний (кавеол) внутрь клетки в особых участках плазматической мембраны, богатых холестеролом и гликолипидами и связанных с белком кавеолином. Кавеолами богаты клетки гладкой мускулатуры, пневмоциты, фибробласты, адипоциты и эндотелиальные клетки. В этом пути участвуют мембранные рецепторы.

3.Макропиноцитоз происходит путем впячивания значительной области мембраны внутрь клетки и образования везикулы (0,5–5 мкм в диаметре), эквивалентной 100 клатриновым вези-

160

кулам по объёму захваченных молекул. Затем такая везикула сливается с эндосомой и лизосомой. Этот эндоцитоз в рецепторах не нуждается (неселективный).

4. Фагоцитоз — это процесс захвата больших частиц диаметром более 0,75 мкм — пыль, клеточный мусор, микроорганизмы и даже клетки, подвергшиеся апоптозу.

Экзоцитоз — это процесс везикулярного транспорта соединений из клетки во внеклеточное пространство. Различают:

1.Ca2+-зависимый экзоцитоз (регулируемый) происходит чаще всего в нейронах и служит для проведения нервных сигналов (в химических синапсах).

2.Ca2+-независимый экзоцитоз (конститутивный) происходит во всех клетках и служит для секреции компонентов внеклеточного матрикса или доставки новосинтезированных мембранных белков, встроенных в плазматическую мембрану.

Внастоящее время известно, что в узнавании и направлении везикул

кнужному месту участвуют v-SNARE (везикулярные) и t-SNARE (target- белки, встроенные в мембрану) белки. В сборке содержимого везикулы и самой везикулы участвуют ЭПР и комплекс Гольджи.

Существует несколько основных сигнальных путей, позволяющих клетке воспринимать внешние стимулы и отвечать на них каким-либо образом (например, воспринимать сигналы от гормонов):

1.MAPK/ERK сигнальная система (англ. Mitogen-activated protein kinase — митогенактивированная протеинкиназа; Extracellular signal-regulated kinases — внеклеточные регулируемые киназы)

— сложная сигнальная система, состоящая из множества белков, среди которых — Ras и Raf-белки.

Пример сигнальной молекулы, активирующей эту систему: ин-

сулин.

2.Аденилатциклазная сигнальная система — сигнальная си-

стема, состоящая из:

а. трансмембранных рецепторов (GPCR), сопряжённых с G- белками;

б. аденилатциклазы (фермента, синтезующего циклический АМФ — вторичный мессенджер в этом сигнальном пути);

в. протеинкиназы А (фермента, фосфорилирующего клеточные белки).

Примеры медиаторов, активирующих эту систему: нуклеозиды,

нуклеотиды, Ca2+, катехоламины и другие биогенные амины, эй-

161

козаноиды, пептидные и белковые гормоны (см. полный список в доп. вопросах).

Описание событий в этой сигнальной системе приведено на Рис. 88 и в комментарии к нему.

Рис. 88. Аденилатциклазная сигнальная система1

1.Гормон связывается с активирующим рецептором Rs и стимулирует связывание рецептора с гетеротримерным Gs-белком.

2.Это приводит к тому, что α-субъединица Gs-белка теряет сродство к связанному с ней ГДФ и обменивает его на ГТФ.

3.Затем комплекс Gsα-субъединицы и ГТФ отщепляется от комплекса двух субъединиц (Gβγ).

4.Комплекс Gsα-субъединицы и ГТФ активирует фермент аденилат-

циклазу.

5.Аденилатциклаза катализирует реакции конверсии АТФ в цАМФ.

1 Номер в списке соответствует номеру стадии на рисунке.

162

6.Активность аденилатциклазы резко снижается после гидролиза Gsα-субъединицей связанного с ней ГТФ до ГДФ и Фн. Этот процесс блокирует холерный токсин.

7.Связывание гормона с ингибирующим рецептором Gi запускает схожий каскад событий (8-11).

8.α-Субъединица Gi-белка теряет сродство к связанному с ней ГДФ и обменивает его на ГТФ. Этот процесс блокирует коклюшный токсин.

9.Комплекс Giα-субъединицы и ГТФ отщепляется от комплекса двух субъединиц (Gβγ).

10.Комплекс Giα-субъединицы и ГТФ ингибирует аденилатциклазу.

11.Ингибирование аденилатциклазы резко прекращается после гидролиза Giα-субъединицей связанного с ней ГТФ до ГДФ и Фн.

12.Синтезированный цАМФ активирует протеинкиназу А (ПкА, R2C2), связываясь с регуляторным димером R2 и вызывая отщепление каталитических субъединиц C.

13.Эта каталитическая субъединица C активирует различные клеточные белки, фосфорилируя их.

14.Этот сигнальный путь контролируется ферментом цАМФ- фосфодиэстеразой, расщепляющим цАМФ до АМФ.

15.Кроме того, определенный контроль осуществляют фосфопротеинфосфатазы, отщепляющие остаток фосфорной кислоты от белков.

3.Инозитолфосфатная сигнальная система — сигнальная си-

стема, состоящая из:

а. трансмембранных рецепторов (GPCR), сопряжённых с

Gq-белками;

б. фосфолипазы С (фермента, гидролизующего фосфатиди- линозитол-4,5-бисфосфат);

в. протеинкиназы С (фермента, фосфорилирующего клеточные белки).

Описание событий в этой сигнальной системе приведено на Рис. 89 и в комментарии к нему.

163

8.Этот сигнальный путь контролируется гидролизом ГТФ до ГДФ и Фн, который осуществляет Gqa-субъединица.

9.Важную роль в регуляции этой сигнальной системы играет фер-

мент инозитолполифосфат-5-фосфатаза, отщепляющий от ИФ3

остаток фосфорной кислоты, что приводит к образованию ИФ2.

Гликолипиды, фосфолипиды, стероиды, липидный бислой, жидкост- но-мозаичная модель, диффузия, пассивный транспорт, активный транспорт, периферические белки, интегральные белки, лиганд, эндоцитоз, экзоцитоз.

1.Строение плазматической мембраны. Химический состав биомембран.

2.Функции биомембран.

3.Транспорт веществ через биомембраны.

4.Эндоцитоз и экзоцитоз.

5.Трансмембранная передача сигнала.



1.Жидкостно-мозаичная модель строения мембран (предложена Джонатаном Зингером и Гартом Николсоном в 1972 году).

2.Типы мембранных белков: интегральные и периферические:

а. Порины как пример интегральных белков: структурные особенности, вторичная и третичная структура таких белков.

б. Цитохром c как пример периферического белка: особенности связывания с мембраной.

3. Виды липидов, входящих в состав мембран: а. фосфолипиды:

плазмалогены;

сфингомиелины;

производные фосфатидной кислоты: фосфатидилэтано-

ламин, фосфатидилсерин, фосфатидилхолин, фосфатидилинозитол.

б. гликосфинголипиды:

цереброзиды;

ганглиозиды;

другие гликосфинголипиды. в. стероиды:

165

холестерол (в мембранах животных клеток);

стигмастерол и эргостерол (в мембранах прокариот, протист и грибов)



1.Пассивный транспорт веществ: а. простая диффузия; б. облегченная диффузия:

белки-переносчики;

каналообразующие белки.

2.Активный транспорт веществ:

а. первично-активный транспорт:

АТФазы P-типа (АТФазы, переносящие, к примеру, Na+, Ca2+, K+);

АТФазы F-типа (протонтранспортирующие АТФазы митохондрий);

АТФазы V-типа (протонтранспортирующие АТФазы в вакуолях растительных и кислых лизосомах животных клеток);

АТФазы A-типа (АТФазы, переносящие анионы);

ABC-переносчики (белки-транспортёры, связывающие АТФ и переносящие целый ряд ионов и малых молекул).

б. вторично-активный транспорт:

Na+ глюкозный симпорт (в эпителиоцитах кишечника);

H+ лактозный симпорт (фермент — лактозная пермеаза или галактозидпермеаза).

в. связь между первично-активным и вторично-активным транспортом. Важно!

3. Транспортные белки.



1.Сигнальные молекулы. Вторичные мессенджеры клетки.

2.Аденилатциклазная система:

а. Строение и функции:

Gαs-белков;

аденилатциклазы;

протеинкиназы А.

б. Медиаторы, активирующие эту систему:

Адренокортикотропный гормон;

Лютеинизирующий гормон;

Фолликулостимулирующий гормон;

Тиреотропный гормон;

Хорионический гонадотропин;

166

Меланоцитстимулирующий гормон;

Кортиколиберин;

Кальцитонин;

Глюкагон.

АТФ (аденозиновые рецепторы A2a, A2b);

Антидиуретический гормон (вазопрессин, рецепторы ти-

па 2);

Гистамин (H2-рецепторы);

Адреналин (β1-, β2- и β3-адренергические рецепторы);

Паратгормон (рецепторы типа 1);

Дофамин (рецепторы D1 и D5);

Простагландины (рецепторы типа D2 и I2).

в. Механизм инактивации аденилатциклазной системы. 3. Инозитолфосфатная система:

а. Строение и функции:

Gαq-белков;

фосфолипазы C;

протеинкиназы C.

б. Медиаторы, активирующие эту систему:

Гистамин (H1-рецепторы);

Серотонин (5-HT2-рецепторы);

Вазопрессин (рецепторы типа 1);

Ангиотензин (рецепторы типа 1);

Адреналин (альфа-1-рецепторы);

Ацетилхолин (мускариновые рецепторы M1, M3 и M5);

Метаботропные глутаматные рецепторы (группа I);

Кальцитонин.

в. Механизм инактивации инозитолфосфатной системы.

1.Что представляют собой липиды? Расскажите о жирных кислотах, ТАГ, фосфоацилглицеролах, восках и сфинголипидах, гликолипидах и стероидах.

2.Как устроен липидный бислой?

3.Как липидный состав бислоя влияет на его свойства?

4.Какие факторы оказывают влияние на текучесть липидного бислоя?

5.Расскажите о том, как связаны белки с мембранным бислоем. Назовите виды вторичных структур, встречающиеся в трансмембранных белках.

6.Опишите ковалентные модификации белков, связанных с липидами мембран.

7.Как осуществляется транспорт веществ через мембрану?

8.Как функционируют мембранные рецепторы?

167

9. Какую роль выполняют липофильные витамины?

10.Как связаны простагландины и лейкотриены с липидами?

168

в. Fe-S центр; г. Гем c1.

5.Цитохром c («с» чит. как

«цэ»).

6.Комплекс IV (цитохром с оксидаза; димер ~410 кДа, 8-13 уникальных субъединиц) включает:

а. Гем a;

б. CuA и CuB (медные центры).

в. Гем a3.

Сдыхательной цепью связан (но

не относится к ней) комплекс V (АТФсинтаза), непосредственно синтезирующий АТФ.

Переносчиками электронов на дыхательную цепь выступают NADH (ни- котинамид-аденин-динуклеотид) и FADH2 (флавин-аденин-динуклеотид). Эти соединения восстанавливаются в ходе разных метаболических путей и циклов (например, в гликолизе, окислительном декарбоксилировании пирувата, ЦТК). Схема переноса электронов изображена на рисунке.

Питер Митчелл предложил хемио-

смотическую теорию в 1961 году.

Лишь спустя 10 лет его теория получила должное внимание и оценку. В 1978 году ему была вручена Нобелевская премия по химии.

Согласно теории Митчелла, свобод-

ная энергия переноса электронов запасается путём переноса протонов H+ из матрикса митохондрий в межмембранное

пространство (и тем самым «запасается») и образования таким образом электрохимического градиента протонов H+. Электрохимический протенциал этого градиента протонов используется для синтеза АТФ. В этом и заключается основной смысл сопряжения дыхания и окислительного фос-

171

форилирования. Некоторые ключевые наблюдения, объясняемые этой теорией:

1.Окислительное фосфорилирование требует интактной митохондриальной мембраны.

2.Внутренняя митохондриальная мембрана непроницаема для ионов (H+, OH–, K+, Cl–), чья диффузия бы нарушила электрохимический градиент.

3.Транспорт электронов сопряжён с переносом протонов из матрикса в межмембранное пространство.

4.Соединения, повышающие проницаемость внутренней митохондриальной мембраны для протонов и тем самым нарушающие электрохимический градиент, не препятствуют транспорту электронов, однако ингибируют синтез АТФ; то есть они «разобщают» процессы переноса электронов и окислительного фосфорилирования.

Рис. 92. Перенос электронов и протонов Комплексом I

Комплексы I, III и IV дыхательной цепи генерируют протонный градиент, транспортируя протоны H+ из матрикса в межмембранное пространство одновременно с переносом электронов. Этот градиент ещё называют протондвижущей силой.

АТФ-синтаза (другие названия: F1F0-синтаза, Комплекс V) представляет собой полисубъединичный трансмембранный белок (фермент) с общей молекулярной массой 450 кДа. Этот белок состоит из 2 частей:

1.F0 встроен в мембрану и состоит из 8 субъединиц.

2.F1 является периферическим мембранным белком из 5 субъединиц: α3β3γδε.

172

фермента. Свободная энергия, обеспечиваемая потоком протонов, способствует отщеплению уже синтезированной молекулы АТФ, т.е. обеспечивает переход сайта в другое состояние: T →O. Это происходит за счет разрыва связей между самим сайтом фермента (комплекса V) и молекулой АТФ.

Рис. 97. Механизм работы АТФ-синтазы

Бойер предположил, что циклические изменения в конформации субъединиц вызваны вращением каталитической части комплекса (α3β3) относительно своей оси. Эта гипотеза была подтверждена с помощью рентгенографических исследований. Действительно, тесная связь между цилиндрической частью комплекса, образованной α- и β-субъединицами, и С-концевым фрагментом γ-субъединицы напоминает подшипник и втулку. Гидрофобные участки этой структуры лишены водородных и ионных связей, которые препятствовали бы вращению. Более того, центральная полость α3β3 обеспечивает свободное движение N-терминального фрагмента γ-субъединицы в пределах её ядра. Наконец, конформация каталитических сайтов компонента F1 связана с положением самой γ-субъединицы. Очевидно, γ-субъединица играет роль распределительного вала, связывающего протондвижущую вращательную часть F0 с конформационными изменениями в каталитических сайтах F1.

Перенос электронов (окисление NADH и FADH2 молекулой кислорода) и окислительное фосфорилирование (синтез АТФ, запускаемый протонным градиентом) обычно тесно сопряжены. Такое сопряжение возможно благодаря непроницаемости внутренней мембраны митохондрий для протонов H+, что в свою очередь позволяет создавать электрохимический градиент протонов при переносе электронов между комплексами в дыхательной цепи. Есть лишь один путь для свободного проникновения протонов в матрикс митохондрий — через F0 компонент АТФ-синтазы. В

176

состоянии покоя, когда окислительное фосфорилирование замедляется, накапливаемый электрохимический градиент препятствует дальнейшей перекачке протонов и тем самым ингибирует перенос электронов.

Некоторые соединения обладают способностью разобщать процессы переноса электронов и синтеза АТФ. 2,4-Динитрофенол (ДНФ) — липофильная слабая кислота, легко проникающая через липидные мембраны в незаряженном, протонированном состоянии. В градиенте pH динитрофенол связывает протоны в кислой среде, диффундирует через мембрану и отдаёт протоны в щелочной среде. Кислая и щелочная среды создаются по обе стороны от внутренней митохондриальной мембраны при перекачке протонов из матрикса митохондрий (щелочная среда у поверхности мембраны) в межмембранное пространство (кислая среда у поверхности мембраны). Динитрофенол является ионофором — веществом, способным переносить протоны — и нарушает протонный градиент.

Рис. 98. Действие 2,4-динитрофенола

Хемиосмотическая теория так объясняет явление разобщения: вещества, находящиеся во внутренней мембране митохондрий и повышающие её проницаемость для протонов H+, разобщают процессы окислительного фосфорилирования и переноса электронов, пропуская эти протоны в обход АТФ-синтазы. При разобщении перенос электронов продолжается, а синтез АТФ приостанавливается. По этой причине динитрофенол использовался как «диетическое средство» в 1920-х годах. Его применяли для ускорения потери веса, однако побочные эффекты оказывались фатальными.

Окислительное фосфорилирование, протонный градиент, восстановительные эквиваленты, дыхательные комплексы, дыхательная цепь, коэффициент P/O, хемиосмотическое сопряжение, ионофор, челночные системы.

177

1.Принципы получения энергии в живых объектах. Носители энергии.

2.Общая характеристика компонентов в дыхательной цепи.

3.Гипотезы сопряжения дыхания и окислительного фосфорилирования. Хемиосмотическая теория Митчелла.

4.Способы разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования.



1.Структура внешней и внутренней мембран митохондрий. Транслоказы.

2.Челночные системы: малат-аспартатная и глицерофосфатная. Схемы.



1.Комплексы I–V: структурные особенности, простетические группы.

2.Принцип работы комплекса V — АТФ-синтазы: F0 и F1 компоненты.

3.Восстановительные эквиваленты: NADH + H+ и FADH2. Их функции.

4.Процесс переноса электронов и протонов комплексами.



1.Хемиосмотическая теория Митчелла.

2.Протондвижущая сила.

3.Связь между переносом электронов и синтезом АТФ.

1.Как строение митохондрий связано с синтезом АТФ?

2.Как можно использовать восстановительные потенциалы для предсказания направления транспорта электронов?

3.Какие реакции происходят в дыхательных комплексах?

4.Расскажите о строении железосодержащих белков дыхательной цепи.

5.Что служит сопрягающим фактором при окислительном фосфорилировании?

6.Что такое «хемиосмотическое сопряжение»?

7.Как влияют на работу дыхательных комплексов специфические ингибиторы?

8.Расскажите, как челночные системы переносят восстановительные эквиваленты в митохондрии.

9.Объясните, как свободная энергия протонного градиента запускает транспорт АТФ, АДФ и Фн.

178

10.Расскажите о разобщении процессов переноса электронов и окислительного фосфорилирования.

179

1.Березов, Т.Т. Биологическая химия: Учебник / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. — 3-изд., перераб. доп. — М.: Медицина, 1998. — 704 с.

2.Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С. Северина. — 2-е изд., испр. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2004. — 784 с.

3.Кольман, Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К.-Г. Рём. — М.: Мир,

2000. — 469 с.

4.Комов, В.П. Биохимия / В.П. Комов, В.Н. Шведова. — М.: Дрофа, 2008. — 640 с.

5.Филиппович, Ю.Б. Основы биохимии: Учеб. для хим. и биол. спец. пед. ун-тов и ин-тов. — 4-е изд., перераб. и доп. / Ю.Б. Филиппович. — М.:

Изд-во «Агар», 1999. — 512 с.

6.Цыганенко, А.Я. Клиническая биохимия / А.Я. Цыганенко, В.И. Жуков, В.В. Мясоедов, И.В. Завгородний. — М.: Триада-Х, 2002. — 504 с.

7.Чиркин, А.А. Биохимия / А.А. Чиркин, Е.О. Данченко. — М.: Медицина,

2010. — 605 с.

8.Щербак, И.Г. Биологическая химия / И.Г. Щербак. — СПб: Издательство СПбГМУ, 2005. — 486 с.

180

Рис. 102. Вторичная и третичная структура 5S рРНК Haloarcula marismortui

184

Рис. 112. Рекомбинация как одна из систем репарации

190

Рис. 114. Модель глюкозного транспорта (ГЛЮТ)

192

Рис. 115. Модель F1 и F0-компонентов АТФ-синтазы

193