Трансляция — это процесс синтеза белка, который происходит на рибосомах с участием мРНК в качестве матрицы. Генетическая информация, закодированная в ДНК, сначала транскрибируется на мРНК, а затем транслируется в цепочку аминокислот. Отрезок мРНК, кодирующий последовательность аминокислот в белке, считывается триплетами (кодонами), каждый из которых соответствует одной аминокислоте.
—Триплетность — каждый кодон состоит из 3 нуклеотидов (триплет).
—Непрерывность — в генетическом коде нет знаков препинания. При синтезе белка код считывается непрерывно.
—Неперекрываемость — один нуклеотид входит в состав лишь одного кодона (исключение: у бактерий и вирусов, а также в митохондриях, существуют перекрывающиеся гены, которые кодируют несколько белков, считывающихся со сдвигом рамки).
—Однозначность (специфичность) — каждый кодон кодирует только одну аминокислоту (исключение: кодон UGA у Euplotes crassus кодирует две аминокислоты — цистеин и селеноцистеин).
—Вырожденность (избыточность) — одна и та же аминокислота может кодироваться несколькими кодонами.
—Универсальность — генетический код работает одинаково в организмах разного уровня сложности — от вирусов до человека (на этом основаны методы генной инженерии; есть ряд исключений, показанный в таблице раздела «Вариации стандартного генетического кода» ниже).
—Помехоустойчивость — мутации замен нуклеотидов, не приводящие к смене класса кодируемой аминокислоты, называют консервативными; мутации замен нуклеотидов, приводящие к смене класса кодируемой аминокислоты, называют радикальными.
Рибосомы — это крупные рибонуклеопротеидные комплексы, состоящие из большой и малой субъединицы. В состав рибосом входят рРНК и белки. Собранные и активные рибосомы имеют 3 сайта: А-сайт (сайт связывания с аминоацил-тРНК), Р-сайт (сайт, в котором находится пепти- дил-тРНК) и Е-сайт (сайт, в котором деацилируется тРНК).
98
Рис. 61. Строение про- и эукариотической рибосомы: большая 50S/60S и ма-
лая 30S/40S субъединицы образуют 70S/80S рибосому
1.Фактор инициации IF-3 связывается с 30S субъединицей рибосом, препятствуя сборке 70S комплекса.
2.Факторы IF-1, IF-2–ГТФ и мРНК связываются с 30S субъединицей в произвольном порядке. Связывание формилметионил-тРНК с 30S субъединицей рибосомы происходит не по принципу кодонантикодоновой комплементарности, а благодаря взаимодействию с фактором IF-2. Фактор IF-3 способствует связыванию мРНК с 30S комплексом. Затем 16S рРНК «находит» на мРНК последователь-
ность Шайна-Дальгарно (5’ GGAGGU 3’), связываясь с ней в этом участке по принципу комплементарности, и устанавливает рамку считывания на инициирующий кодон AUG (см. Рис. 63).
3.50S субъединица присоединяется к 30S инициаторному комплексу. Факторы IF-1 и IF-3 отщепляются. ГТФ, связанный с IF-2, гидролизуется до ГДФ и Фн (неорганический фосфат). Комплекс IF-2 + ГДФ диссоциирует от 70S рибосомы, связанной в P-сайте с метионилтРНК (см. Рис. 62).
99
Рис. 62. Инициация трансляции у прокариот
Рис. 63. Узнавание последовательности Шайна-Дальгарно у кишечной па-
лочки E. coli
100
1.40S субъединица рибосом связывается с факторами eIF-1A и eIF-3. Затем к 40S частице присоединяется фактор eIF-2 + ГТФ + мет-тРНК. Формируется преинициационный комплекс 43S.
2.43S комплекс связывается с факто-
рами eIF-4E, eIF-4G, eIF-4A, eIF-4B и
мРНК в области 5’-кэпа. У эукариотических мРНК отсутствует последовательность Шайна-Дальгарно, поэтому у них существует сканирующий механизм обнаружения старт-кодона AUG. eIF-40S комплекс движется по цепи мРНК до т.н. последовательности Ко́зака(–3ACCAUGG+4). Рибосома может пропустить первый встретившийся ей кодон AUG, если он не образует последовательность Козака. В конце данного этапа формируется 48S комплекс.
3.Происходит гидролиз ГТФ, факторы инициации отщепляются, присоединяется 60S субъединица и формируется 80S инициационный комплекс.
1.Декодирование (связывание ами-
ноацил-тРНК). После инициации в P- сайте рибосомы уже находится инициирующая формилметионил-тРНК. В А-сайте происходит связывание второй аминоацил-тРНК, закодированной в мРНК. В этом процессе участвует фактор EF-Tu, направляющий аминоацил-тРНК в А-сайт. Если антикодон на аминоацил-тРНК оказывается комплементарен кодону на мРНК, происходит стабилизация
101
Рис. 64. Элонгация трансляции у прокариот: транспептидация и транслокация
комплекса EF-Tu + ГТФ + аат-тРНК и гидролиз ГТФ до ГДФ и Фн. EFTu + ГДФ диссоциирует от рибосомы, связывается с фактором EF-Ts. ГДФ обменивается на ГТФ и EF-Ts отщепляется от EF-Tu.
2.Транспептидация (образование пептидной связи). Происходит образование пептидной связи по механизму нуклеофильной атаки. Реакция катализируется пептидилтрансферазным центром большой субъединицы рибосом (РНК-катализируемая реакция). Растущая полипептидная цепь оказывается связанной с тРНК в А-сайте. В Р-сайте находится уже свободная тРНК.
3.Транслокация. Третий фактор элонгации EF-G + ГТФ связывается с рибосомой. Происходит гидролиз ГТФ до ГДФ и Фн. EF-G + ГДФ отщепляется, а рибосома транслоцируется на один кодон далее по цепи мРНК. Свободная тРНК перемещается из P-сайта в E-сайт. ПептидилтРНК переносится из A-сайта в P-сайт. А-сайт остаётся свободным.
Эта стадия трансляции у эу- и прокариот очень схожа. У эукариот вместо фактора EF-Tu — EF-1α. Вместо EF-Ts — EF-1β. Аналогом прокариотического EF-G является EF-2.
1.Как только в А-сайте оказывается один из стоп-кодонов (UAG, UGA, UAA), с ним связывается релиз-фактор: RF-1 или RF-2. Он переносит пептидильную группу с тРНК (полипептидную цепь) на молекулу воды, вызывая её высвобождение.
2.Фактор RF-3 связывается с рибосомой в комплексе с ГДФ. Происходит замена ГДФ на ГТФ. Релиз-фактор RF-1/2 высвобождается. RF-3 гидролизует ГТФ до ГДФ и отщепляется от рибосомы.
3.К рибосоме присоединяется фактор RRF (ribosomal recycling factor) и EF-G + ГТФ. EF-G гидролизует ГТФ, благодаря чему RRF перемещается в P-сайт, а тРНК находящиеся в E- и P-сайтах, отщепляются.
4.Большая и малая субъединицы рибосом диссоциируют. В этом процессе участвует фактор IF-3.
Уэукариот всего один релиз-фактор — eRF-1 — связывается со всеми тремя стоп-кодонами и катализирует гидролиз связи между С- терминальной аминокислотой в синтезированной полипептидной цепи и тРНК. У эукариот существуют т.н. суппрессорные тРНК, позволяющие трансляции продолжаться даже при достижении стоп-кодона.
102
Фолдинг белков, т.е. принятие ими нативной конформации, происходит по мере синтеза растущей полипептидной цепи. В этом процессе участвуют белки-шапероны. Модификация аминокислотных остатков в белке может осуществляться во время и после трансляции. Белки, синтезированные на цитозольных рибосомах, остаются в цитозоле или переносятся в митохондрии, пероксисомы или ядро. Белки, синтезированные рибосомах, связанных с гранулярным ЭПР, предназначены для лизосом, клеточных мембран или экспорта из клетки. Такие белки транспортируются в аппарат Гольджи, где они модифицируются и перенаправляются по назначению.
Перечень известных посттрансляционных модификаций белков достаточно широк. Несколько примеров:
1.N-терминальный аминокислотный остаток метионина или формилметионина обычно вырезается.
2.Остатки пролина и лизина в коллагене гидроксилируются (к ним присоединяются OH-группы);
3.Мембранные белки обычно подвергаются гликозилированию (присоединение углеводных групп), пренилированию (присоединение остатков изопреноидов) и ацилированию (присоединение остатков жирных кислот).
4.Белки, синтезированные в неактивной форме, обычно подвергаются протеолизу (отщеплению части цепи). Так, к примеру, активируются зимогены сериновых протеаз.
5.Белки, транспортирующиеся в ЭПР, обычно содержат сигнальный пептид, который затем отрезается. Это характерно для гормона инсулина, который синтезируется в форме препроинсулина, который сначала превращается пропротеин, а затем в активный белковый гормон.
6.Белки гистоны подвергаются посттранляционному метилированию, ацетилированию и фосфорилированию по остаткам аргинина, глутамата, гистидина, лизина, серина, треонина и тирозина.
103
Рис. 65. Элонгация трансляции у прокариот: декодирование и «вставка» ами-
ноацил-тРНК в А-сайт.
Аминоацил-тРНК, кодон, рамка считывания, инициационный кодон, терминирующие кодоны, антикодон, последовательность ШайнаДальгарно, А-сайт, P-сайт, E-сайт, инициационный комплекс, транслокация, пептидилтрансферазная активность, релиз-факторы, полисома, посттрансляционная модификация, сигнальная последовательность, убиквитин, протеасома.
1.Генетический код и его характерные черты.
2.Компоненты белок синтезирующей системы клетки.
104
3.Инициация трансляции.
4.Элонгация трансляции.
5.Терминация трансляции.
6.Посттрансляционная модификация.
1.Свойства генетического кода: триплетность, непрерывность, неперекрываемость, однозначность (специфичность), вырожденность (избыточность), универсальность, помехоустойчивость.
2.Кодоны: кодирующие аминокислоты, терминирующие (стопкодоны), инициационный (старт-кодон).
3.Понятие об антикодоне.
1.Аминоацилирование тРНК.
2.Аминоацил-тРНК-синтетазы: классы I и II, специфичность, частота ошибок.
1.Строение рибосом у прокариот.
2.Строение рибосом у эукариот.
3.A, P и E-сайты рибосом.
4.Понятие о полисомах.
1.Правильная рамка считывания и роль последовательности ШайнаДальгарно в корректном расположении рибосом и мРНК относительно друг друга.
2.Инициационный комплекс: мРНК, 30S-субъединица рибосомы, меттРНК, ГТФ и факторы инициации — IF-1, IF-2, IF-3.
3.Инициирующая тРНК.
1.Факторы: eIF1, eIF1A, eIF2, eIF2B, eIF2C, eIF3 (p35, p36, p40, p44, p47, p66, p115, p170), eIF4A, eIF4B, eIF4E, eIF4G, eIF4F, eIF5, eIF6. Их роль.
2.Отсутствие последовательности Шайна-Дальгарно и участие кэпа (5’- конец мРНК) в правильной ориентации рибосом и цепи мРНК. Связывание поли-А-хвоста с eIF4G. Последовательность Козак.
105
1.Роль факторов элонгации: EF-Tu, EF-Ts, EF-G.
2.Реакция транспептидации.
3.Реакция транслокации. Участие фактора EF-G.
1.Стоп-кодоны: UAA, UAG и UGA. Релиз-факторы: RF-1, RF-2, RF-3. Их взаимодействия.
1.Релиз-фактор (один!) и его взаимодействие со стоп-кодонами.
2.Понятие о суппрессорной тРНК.
1.Существование внутриядерного синтеза белков. Процент синтезируемых белков в ядре. Присутствие компонентов, необходимых для синтеза белка в ядрах эукариот.
1. Роль шаперонов, ассоциированных с рибосомами.
1.Роль лидерных (т.е. сигнальных) последовательностей у белков.
2.Органеллы, в которых происходит модификация белков: ЭПР и аппарат Гольджи.
3.Модификации:
а. деформилирование N-концевого аминокислотного остатка у прокариот;
б. удаление N-концевого остатка метионина из про- и эукариотических белков;
в. образование дисульфидных мостиков, протеолиз под действием протеиназ;
г. фосфорилирование; д. присоединение углеводных групп (гликозилирование); е. ацетилирование.
1.Роль протеасом.
2.Роль убиквитина.
3.Участие ферментов E1, E2 и E3 в расщеплении белковой молекулы.
106
1.Как удалось расшифровать генетический код?
2.Почему количество тРНК меньше, чем число кодонов?
3.Что называют «вторым генетическим кодом»?
4.Расскажите о значении факторов инициации, элонгации и терминации.
5.Как рибосома образует пептидную связь между остатками аминокислот?
6.Как рибосома узнает, с какого кодона на мРНК начинать синтез?
7.Почему фактор EF-Tu так важен для E. coli?
8.В чем отличия эукариотической трансляции от прокариотической?
9.Назовите несколько видов посттрансляционной модификации белков.
10.Как клетка узнает, какие белки необходимо подвергнуть расщеплению?
107
Регуляция экспрессии генов осуществляется в основном на уровне транскрипции. Возможно, это связано с тем, что прокариотические мРНК имеют короткий «срок жизни» — всего несколько минут.
Лактозный оперон (lac-оперон) — это полицистронный ген у кишечной палочки (E. coli), кодирующий 3 белка: β-галактозидазу, галак-
тозидпермеазу, тиогалактозид-трансацетилазу. Эти белки участвуют в усвоении лактозы кишечной палочкой.
В норме (при отсутствии лактозы в среде) лактозный оперон выключен: промотор оперона блокирован lac-репрессором — он препятствует транскрипции, поскольку не даёт РНК-полимеразе возможности корректно начать её (связаться с
промотором полимераза всё-таки может, как было показано в последние годы) (см. Рис. 66).
Как только лактоза появляется в среде, она попадает в клетку и связывается с lac-репрессором. Это ме-
няет его конформацию, он становится неактивен, утрачивает своё сродство к промотору и отщепляется. На lac-опероне начинается транскрипция, а затем происходит трансляция мРНК на белок (см. Рис. 67). Синтезированные ферменты помогают клетке «усвоить» лактозу:
1.Галактозидпермеаза служит мембранным переносчиком лактозы в клетку (ускоряет её перенос в разы);
2.β-Галактозидаза расщепляет лактозу до глюкозы и галактозы, которые затем включаются в гликолиз.
Вэтом механизме регуляции — индукции — лактоза является индуктором, в отсутствии неё репрессор выключает транскрипцию на опероне. Такую регуляцию называют негативной.
108
Рис. 67. Активация лактозного оперона: лактоза появляется в среде, связывается с репрессором, выключает его, начинается транскрипция и трансляция lac- оперона
Помимо индукции, у кишечной палочки существует механизм пози-
тивной регуляции — катаболическая репрессия.
Пример: рассмотрим случай, когда клетка E. coli получает из среды как глюкозу, так и лактозу (а не только лактозу). Глюкозы вполне достаточно для того, чтобы снабжать клетку энергией, поэтому несмотря на появление лактозы в среде, транскрипции lac-оперона не происходит или она идёт очень медленно. Такой эффект достигается с помощью особого белка — CAP (англ. catabolite gene activator protein). В своём активном со-
стоянии (комплекс CAP + цАМФ) этот белок связывается с промотором и «усиливает» его (помогает РНК-полимеразе начать транскрипцию). Однако, если в клетке достаточно глюкозы, концентрация цАМФ, который необходим для активации CAP-белка, низкая, и активации транскрипции не происходит. Так клетка экономит ресурсы и не синтезирует белки для усвоения лактозы, пока в среде есть глюкоза.
Триптофановый оперон (trp-оперон) — это полицистронный ген у кишечной палочки E. coli, кодирующий 5 полипептидных цепей, которые затем образуют 3 белка:
1.Антранилатсинтаза;
2.N-(5’-фосфорибозил)-антранилатизомераза и индол 3-
глицеролфосфатсинтаза (комплексный фермент с двумя активными центрами);
3.Триптофансинтаза.
Эти белки синтезируют триптофан из хоризмовой кислоты. В норме триптофановый оперон включён: trp-репрессор синтезируется неактив-
109
ным (в отличие от lac-репрессора, который после синтеза сразу активен). Как только белки, кодируемые trp-опероном, синтезируют избыток триптофана, его молекулы соединяются с trp-репрессором и активируют его. Комплекс trp-репрессор + триптофан связывается с оператором trp- оперона и снижается частоту транскрипции на нём примерно в 70 раз. Как только концентрация триптофана в среде снова снижается, trp-репрессор переходит в неактивное состояние, и транскрипция на trp-опероне возобновляется.
В этом механизме регуляции — репрессии — триптофан является
корепрессором.
Ранее считалось, что репрессия — единственный механизм регуляции экспрессии триптофанового оперона. Однако впоследствие стало известно о существовании ещё одного — аттенуации. Участок ДНК, отвечающий за этот вид регуляции, был назван аттенуатором (см. Рис. 68).
РНК-полимераза, избежавшая репрессии (к примеру, в результате спонтанной диссоциации активного комплекса trp-репрессор + корепрессор), инициирует транскрипцию на trp-опероне. После транскрипции на мРНК сайта инициации трансляции происходит сборка рибосом на данном участке и трансляция лидерного пептида.
Если в клетке достаточно высокая концентрация триптофана (а
значит, и аминоацилированных trp-тРНКtrp), РНК-полимераза делает паузу на 92 нуклеотиде транскрипта и «дожидается» рибосомы, тем самым обеспечивается сопряжение процессов транскрипции и трансляции. Рибосома приближается к РНК-полимеразе и находится сразу позади неё. Приближение рибосомы и наличие в клетке trp-тРНКtrp препятствует формированию антитерминаторной шпильки 2 • 3 и приводит к появлению терминаторной шпильки 3 • 4. Эта шпилька препятствует дальнейшей транскрипции trp-оперона.
В случае же, когда триптофана в среде мало, рибосома делает паузу на паре кодонов UGG (кодирующих именно триптофан), поскольку trpтРНКtrp в среде отсутствуют. РНК-полимераза не встречается с рибосомой
ипродолжает двигаться. Транскрипция не останавливается, и сегменты 2
и3 формируют антитерминаторную шпильку (2 • 3). При этом терминаторная шпилька не образуется. Транскрипция на trp-опероне не прекращается.
110
Рис. 68. Аттенуация на примере trp-оперона
Эукариотические организмы имеют значительное более сложную регуляцию экспрессии генов, чем прокариотические. Основные отличия:
1.Эукариотическая ДНК имеет огромные размеры по сравнению с прокариотической. К примеру, кишечная палочка E. coli имеет одну кольцевую хромосому (4 миллиона нуклеотидных пар), а самый примитивный эукариотический организм — Saccharomyces cerevisiae — имеет 16 хромосом, и длина его ДНК
— 16 миллионов нуклеотидных пар.
2.Эукариотическая ДНК связана с белками гистонами и образует хроматин. Хроматин состоит из повторяющихся элементов — нуклеосом (см. тему 3). Каждая молекула гистона в нуклеосоме имеет N-терминальный «хвост», который может ковалентно модифицироваться. Именно эта модификация гистонов играет значимую роль в регуляции экспрессии эукариотических генов.
3.Эукариотические гены не организованы в опероны. Гены, кодирующие белки, участвующие в одном метаболическом пути, часто находятся в разных частях генома. Однако у эукариот существует кластеризация генома — некоторые гены объедине-
ны в кластеры.
111
Эукариотические организмы имеют множество транскрипционных факторов и несколько механизмов регуляции:
1.Факторы взаимодействуют с РНК-полимеразой;
2.Факторы взаимодействуют с другими белками, связанными с РНК-полимеразой.
3.Факторы участвуют в модификации хроматина. Транскрипционные факторы иногда нуждаются в активации. В этом
процессе участвуют гормоны и различные сигнальные пути клетки.
Все мРНК у эукариот имеют период «полужизни» или полураспада. Основной путь деградации мРНК заключается в постепенном отщеплении нуклеотидных остатков от поли-(А)-хвоста мРНК ферментами деаденилазами. Как только длина хвоста сокращается до 10 нуклеотидных остатков, он уже не может взаимодействовать с поли-(А)-связывающим белком. Происходит отщепление кэпа декэпирующим ферментом. Такая мРНК, лишившаяся кэпа и поли-А-хвоста, расщепляется экзонуклеазами (Xrn1 и экзосомой).
Феномен РНК интерференции заключается в связывании коротких
(18-25 нуклеотидов) микроРНК и малых интерферирующих РНК с ком-
плементарной им мРНК. Такие двухцепочечные РНК затем разрезаются на короткие двухцепочечные фрагменты под действием белка Dicer. Такие фрагменты затем связываются с RISC-комплексом (RNA-induced silencing complex). Он использует их для связывания с уже другой молекулой комплементарной мРНК.
Для механизмов регуляции на стадии трансляции характерна меньшая экономичность и при этом быстрота реагирования на изменения клеточной потребности в данном белке. В большинстве случаев регуляция трансляции осуществляется на стадии инициации.
Механизмы регуляции трансляции:
1.Дискриминация мРНК (англ. discriminate —отличать, распо-
знавать; имеется как у про-, так и у эукариот). Рибосомы либо сами (у прокариот), либо с помощью белковых факторов инициации (у эукариот) «распознают», с каких мРНК им строить много копий белка, а с каких – мало. Это способ позитивной ре-
112
гуляции на основе сродства мРНК к рибосомам и факторам инициации трансляции.
Разные мРНК могут значительно отличаться по скорости и частоте сборки на них рибосом (т.е. уже на стадии инициации трансляции):
—«сильные» мРНК легко связываются с рибосомой, в единицу времени с ними успевает «связаться» много рибосом, поэтому синтезируется много белка;
—на «слабых» мРНК сборка рибосом происходит медленнее, поэтому и продукция белка невысока.
Структурные белки мембран, рибосомные белки, факторы элонгации, белки оболочки вирусов и другие белки, требующиеся в больших количествах кодируются сильными мРНК, а многие специализированные ферменты и регуляторные белки — слабыми мРНК.
Сильной или слабой окажется мРНК — зависит от строения ее 5’-концевых инициирующих и рибосомсвязывающих участков. У прокариот дискриминация идет из-за разного сродства рибосом к этим участкам, а у эукариот — из-за разного сродства к этим же участкам белков — факторов инициации трансляции.
2.Трансляционная репрессия (как у про-, так и у эукариот) и
маскирование мРНК (только у эукариот) — негативная регуляция либо с помощью белков, либо с помощью особых микроРНК, находящихся в составе белковых комплексов.
Впервом случае белком-репрессором может быть:
—Сам синтезируемый по данной мРНК белок. Например, если в бактериальной клетке возникает избыток фермента треонил-тРНК-систетазы, этот фермент становится репрессором, блокируя свой собственный синтез.
—Специальный белок, на данной мРНК не закодированный. Способность такого белка связываться с определенными мРНК зависит от присутствия того или иного низкомолекулярного компонента – эффектора. Например, у животных синтез железозапасающего белка ферритина заблокирован белком-репрессором IRP и разблокируется лишь после взаимодействия репрессора с эффектором – ионами железа. Если железа в среде мало, то ферритин – белок для его связывания – не нужен. В этих условиях репрессор IRP (iron-regulatory protein) присоединен на мРНК, кодирующей ферритин, к специальному регуляторному эле-
менту IRE (iron-responsive element). Если в среде появля-
ется железо, оно связывается с IRP и в 50 – 100 раз понижает сродство репрессора к мРНК. В результате мРНК
113
разблокируется, и с нее начинается синтез ферритина. Он идет до тех пор, пока не иссякнет запас железа в среде.
Во втором случае присоединение к мРНК антисмысловой микроРНК также вызывает трансляционную репрессию, причины которой в настоящее время продолжают изучаться. Способами 1 и 2 трансляция каждой мРНК может контролироваться независимо от других мРНК.
3.Тотальная регуляция трансляции затрагивает все мРНК в клетке (только у эукариот) и осуществляется путем изменения активности факторов инициации трансляции (как правило, через инактивацию фактора eIF-2). Например, фосфорилирование фактора eIF-2 приводит к его инактивации (например, так регулируется синтез глобина в ретикулоцитах).
Индукция, репрессия, индуктор, активатор, оператор, отрицательная регуляция, положительная регуляция, оперон, регулон, аттенуация, энхансер, медиатор, ТАТА-связывающий белок, гормональные элементы ответа.
1.Подавление биосинтеза белка.
2.Регуляция доступа к промотору и частоты экспрессии генов.
3.Индукция.
4.Репрессия.
1.«Сильные» и «слабые» промоторы.
2.Участие σ-субъединицы в узнавании различных промоторов.
3.Белки конститутивные и регулируемого синтеза (индуцибельные и репрессируемые).
4.Изменение β-субъединицы РНК-полимеразы вирусом.
5.«Строгий ответ» (с помощью гуанозинтетрафосфата, ффГфф).
6.Аттенуация транскрипции.
7.Rho-зависимая и независимая терминация и её роль в регуляции.
8.Антитерминация транскрипции.
114
1.Понятие о сайленсерах, энхансерах и инсуляторах.
2.Транскрипционные факторы: активаторы и репрессоры.
3.Эффекторы.
4.Медиаторы.
5.Множественность РНК-полимераз.
6.Химические изменения в хроматине (деспирализация и перестройка гистонов), метилирование ДНК, реаранжировка генов.
7.Участие ген-специфичных белковых факторов в регуляции на этапах элонгации и терминации. Участие факторов-рецепторов тиреоидных и стероидных гормонов.
8.Сплайсинг как механизм регуляции.
9.«Ответные элементы» транскрипции: HSE, GRE, MRE, CRE. Принципы работы.
1.Дискриминация мРНК.
2.Трансляционная репрессия (как у про-, так и у эукариот) и маскирование мРНК (только у эукариот).
3.Роль малых РНК в регуляции биосинтеза белка: антисмысловые РНК и РНК-интерференция. Роль микроРНК.
4.Тотальная регуляция.
5.Контроль расщепления белка.
1.Механизм индукции на примере lac-оперона (лактозного оперона).
2.Индуктор: механизм действия.
1.Механизм репрессии на примере trp-оперона (триптофанового оперона).
2.Корепрессор: механизм действия.
1.Расскажите об организации генома клетки. Что такое генные кластеры? Какое количество генов имеют организмы разных систематических категорий?
2.В чем преимущество организации генов в виде оперонов?
3.Опишите регуляцию lac-оперона с помощью lac-репрессора и CAPбелка.
4.Сравните регуляцию lac- и trp-оперонов.
115
5.Как конформация мРНК участвует в регуляции экспрессии гена при аттенуации?
6.Расскажите о регуляции биосинтеза белка на уровне рибосом.
7.Почему перестройка хроматина необходима для эффективной регуляции экспрессии генов? Расскажите о ковалентной модификации гистонов (ещё один способ регуляции экспрессии генов). Опишите, как гистоны влияют на строение нуклеосом и активность транскрипционных факторов.
8.Как гормональная регуляция связана с экспрессией генов?
9.Расскажите об этапах РНК интерференции.
10.Сравните сайленсинг генов с помощью миРНК и микроРНК.
116
Мутация — это наследственно закреплённое изменение в нуклеотидной последовательности генома организма или вируса.
Мутации можно разделить на 4 класса (по вызвавшим их причинам): 1. Спонтанные мутации:
а. Изомеризация (изменение положение атома водорода, а, следовательно, и нарушение водородных связей между основаниями);
б. Депуринизация (отщепление пуринового основание и образование апуринового сайта);
в. Дезаминирование (отщепление аминогруппы и замещение её кетогруппой);
г. «Соскальзывание» цепи (денатурация новосинтезированной дочерней цепи во время репликации и её ренатурация в некорректном положении; может повлечь за собой инсерции или делеции).
2.Мутации, возникшие в результате ошибок репликации (происхо-
дят, когда во время репликации ДНК-полимераза «встречает» однонитевой разрыв, нуклеотидный остаток без азотистого основания или химически модифицированное основание);
3.Мутации, появившиеся в ходе самой репарации ДНК (происходят во время репарации двунитевых разрывов — с концов цепей отщепляются несколько нуклеотидов, а значит, утрачивается значимая часть генетического кода);
4.Индуцированные мутации:
а. Мутации, вызванные химическими агентами; б. Мутации, вызванные радиацией.
1. Малые мутации (генные):
а. Точечные:
—Транзиции: замена одного пуринового основания на другое (или одного пиримидинового — на другое) — A ↔ G или C ↔ T.
—Трансверсии: замена пуринового основания на пиримидиновое и наоборот — C/T ↔ A/G.
117
Точечные мутации происходящие в области ДНК, кодирующей белок, можно дополнительно разделить на 3 класса:
—Сеймсенс мутации (англ. same sense, молчащие мутации): замены кодируемой аминокислоты не происходит из-за
вырожденности кода;
—Миссенс мутации (англ. missense): происходит замена кодируемой аминокислоты;
—Нонсенс мутации (англ. nonsense): в результате мутации образуется стоп-кодон, вызывающий досрочное прекращение синтеза белка, и, как следствие, дефектную поли-
пептидную цепь.
б. Инсерции: вставка одного или нескольких нуклеотидов в ДНК. Влияние на кодируемый белок: изменение сайта сплайсинга мРНК и изменение рамки считывания.
в. Делеции: «выпадение» одного или нескольких нуклеотидов из ДНК. Влияние на кодируемый белок: изменение рамки считы-
вания.
2. Крупные мутации:
а. Амплификации (генные дупликации): увеличение копий об-
ластей ДНК (а значит, и генов, которые в них содержатся).
б. Делеции: выпадение целых участков хромосом (вследствие этого происходит утрата генов).
в. Мутации, приводящие к сближению раннее удаленных друг от друга областей генома и образованию новых, «смешанных ге-
нов»:
—Хромосомные транслокации: обмен участками между не-
гомологичными хромосомами.
—Внутрихромосомные делеции: «выпадение» участка из хромосомы, сближение ранее удаленных друг от друга генов.
—Хромосомные инверсии: поворот участка хромосомы.
г. Утрата гетерозиготности: утрата одного аллеля в результате делеции или рекомбинации.
1. Геномные:
а. Полиплоидия (кратное увеличение общего числа хромосом в геноме);
б. Анеуплоидия (некратное изменение числа отдельных хромосом);
118