- •Лабораторная работа № 8 Методы экспресс – диагностики функционального состояния спортсменов
- •Основные биохимические показатели состава крови и мочи, их изменение при мышечной деятельности
- •Лабораторная работа № 8 Методы экспресс – диагностики функционального состояния спортсменов
- •Опыт 1. Количественное определение глюкозы в биологических жидкостях.
- •Опыт 1.3.1. Определение оптической плотности глюкозы в полученном фильтрате.
- •Опыт 1.3.2. Определение оптической плотности глюкозы в калибровочном растворе.
- •Опыт 2. Определение количества глюкозы в крови ортотолуидиновым методом.
- •Опыт 5. Обнаружение свободного креатина в безбелковом экстракте из мышечной ткани.
- •Опыт 6. Обнаружение молочной кислоты в безбелковом мышечном экстракте.
- •Литература по теме:
Опыт 1.3.1. Определение оптической плотности глюкозы в полученном фильтрате.
В микропипетку набирают 0,2 мл полученного фильтрата, переносят его в высокую тонкостенную сухую пробирку и добавляют 2 мл ортотолуидинового реактива (раствор о-толуидина в уксусной кислоте). Работают осторожно, под тягой, так как о-толуидин является ядовитым веществом. Пробирку закрывают алюминиевой фольгой и помещают точно на 8 мин в кипящую водяную баню, следя за тем, чтобы вода всё время кипела. После этого достают пробирку из водяной бани и быстро охлаждают в токе холодной воды до 20º С. Её содержимое переносят в кювету на1 см и фотометрируют при длине волны 630 нм против раствора сравнения.
Полученные данные записывают в таблицу.
Значение оптической плотности глюкозы
№ пробирки |
Фильтрат, мл |
Калибровочный раствор, мл |
Реактив, мл |
Д (оптическая плотность) |
1 |
0,20 |
- |
2,0 |
|
2 |
- |
0,20 |
2,0 |
|
Раствор сравнения готовят, смешивая 0,2 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 2 мл ортотолуидинового реактива, но в качестве его обычно используют воду. Это связано с тем, что в ТХК не содержится даже следов глюкозы, поэтому окраска с ортотолуидиновым реактивом не развивается. Для
Получения точных данных измерение должно быть проведено не позже 30 мин после охлаждения пробирок!
Опыт 1.3.2. Определение оптической плотности глюкозы в калибровочном растворе.
Готовят калибровочный раствор глюкозы с концентрацией10 ммоль/л. Для этого к 0,2 мл эталонного раствора глюкозы (концентрация 25 ммоль/л) прибавляют 0,3 мл дистиллированной воды. Определение оптической плотности полученного раствора ведут аналогично определению оптической плотности глюкозы в полученном фильтрате (п. 1.3.1.) и параллельно ему. Эталон и раствор сравнения не центрифугируют. Пробу и калибровочный раствор можно отмерять одной и той же микропипеткой. Результат определения записывают в таблицу.
При повышенных концентрациях глюкозы, особенно при анализе мочи, пробу необходимо разводить 2 и даже 10 раз дистиллированной водой. Дальнейший ход работы остается без изменений, а результаты анализа умножают на число разведений.
Опыт 1.4. Определение содержания глюкозы.
Содержание глюкозы рассчитывают по формуле:
А
Х=⋅ 10,
Б
где X – содержание глюкозы, ммоль/л;
А – оптическая плотность пробы;
В – оптическая плотность эталона;
10 – концентрация глюкозы в калибровочном растворе, ммоль/л.
Для определения содержания глюкозы в мг используют следующее отношение: ммоль/л = 0,0555 мг/100 мл.
При нормальных и повышенных концентрациях глюкозы ошибка определения составляет около ±2%, а при пониженных её концентрациях ошибка составляет около ±7–8%.
Для достижения правильных результатов необходимо строго соблюдать постоянство условий нагревания. Растворы должны нагреваться в одинаковых пробирках, иначе нагревание будет неравномерным. В случае необходимости объем пробы, а также объем всех других растворов можно увеличить вдвое.
Полученные результаты опыта , включая уравнения протекающих реакций, экспериментальные данные, расчёты и выводы записать в тетрадь.