3.2.3. Влияние синхронизации клеточного деления на микробную популяцию.
Кривые роста, предоставленные в виде зависимости числа клеток от времени культивирования иногда показывают необычно быстрое увеличение числа клеток сразу после лаг-фазы, вслед за чем скорость накопления клеток понижается. Такое необычное значительное ускорение роста связанно с частичной или полной синхронизацией деления клеток в культуре.
Синхронный рост может быть обусловлен приспособлением культуры к новому питательному субстрату, после чего происходит одновременное деление клеток, в результате одновременного прорастания спор в вегетативные клетки. Затем синхронность культуры быстро нарушается и через 2-3 генерации преобладает обычный асинхронный рост.
В настоящее время разработаны специальные методы, с помощью которых можно синхронизировать деление клеток в растущей популяции, так что рост популяции соответствует росту отдельных клеток. К синхронизации роста в периодическом режиме культивирования чаще всего прибегают с целью изучения метаболических процессов, связанных с определенными этапами цикла развития индивидуальных клеток. Синхронизация культуры наступает в том случае, когда все клетки начинают делиться с почти одинаковой скоростью При этом зависимость логарифма числа клеток от длительности культивирования приобретает ступенчатый характер в отличии от линейного при обычном асинхронном росте в периодическом режиме культивирования.
Несмотря на то, что развитие синхронной культуры происходит довольно равномерно, сохранить синхронность в течении длительного времени трудно, поскольку требуется точный контроль.
Синхронизация культуры может быть достигнута путем изменения лимитирующих факторов среды. К числу технических приемов вызывающих синхронизацию деления клеток, относятся подавление, ускорение или задержка их метаболических функций циклическим способом. При этом популяция постепенно синхронизирует свой ответ на периодические колебания метаболической активности, а затем и показатели роста. Однако, этот метод требует значительного вмешательства в нормальный процесс метаболизма, поэтому его использование ограниченно. Единственным исключением является прорастание бактериальных спор как показатель начинающейся синхронизации. Для этого резкими изменениями состава среды стимулируют прорастание спор и тем самым моделируют процессы, близкие к естественным. Однако достичь 100%-го образования спор или их прорастания практически невозможно, да и далеко не все культуры, синхронизировать которые необходимо, являются спорообразующими. Поэтому для получения однородной по своему физиологическому состоянию популяции требуется применение некоторых физических способов предварительной селекции.
Общепринятый метод синхронизации культур основан на физическом выделении гомогенной в физиологическом отношении фракции клеток из гетерогенной популяции. Такой подход называют синхронизацией путем селекции, что позволяет избежать проблем, связанных с нарушением метаболизма.
Любая гетерогенная популяция бактериальных клеток содержит в своем составе клетки готовые к делению, клетки только что разделившиеся и клетки находящиеся в стадии роста (наращивания цитоплазматической массы). Готовые к делению и только что разделившиеся клетки имеют самую высокую плотность, несмотря на различия их в размерах, а клетки, находящиеся в стадии роста, имеют наименьшую плотность, что и позволяет разделить их на различные фракции методом центрифугирования в градиенте плотности. Для более точного фракционирования клеток, по мимо градиенты плотности, избирают скорость и время центрифугирования, в зависимости от видовых особенностей культуры. Фракция с наибольшей плотностью (осадок) обычно содержит и молодые (дочерние) и зрелые (готовые к делению) клетки, а фракция с наименьшей плотностью (надосадочная жидкость)состоит из однородной гомогенной популяции клеток, находящихся в одинаковой стадии роста. Именно эта фракция используется в качестве посевного материала для осуществления синхронного роста.
Отобрав из центрифужной пробирки самую легкую фракцию клеток, её переносят в емкость подогретой ростовой средой. Тщательно измеряют оптическую плотность засеянной среды, чтобы затем определять её ступенчатое увеличение, свидетельствующее о синхронном росте культуры.
Синхронность культуры поддерживается в течение 2-4 циклов деления клеток. Если необходим более длительный период, то синхронность приходится устанавливать заново с помощью тех же технических приемов.