3.Физиология роста и фазы развития микробной популяции в питательной среде.

Под ростом понимают необратимое увеличение количества живого вещества, обычно связанное с увеличением с делением клеток. У многоклеточных организмов увеличиваются размеры тела, у одноклеточных растет число клеток. Однако и у одноклеточных следует отличать увеличение числа клеток от увеличения клеточной массы.

При определении числа или массы бактерий пользуются обычно гомогенной суспензией клеток в какой-либо жидкой среде и определяют концентрацию бактерий (число клеток на 1мл) или плотность бактерий (в мг/мл).

На основе данных об увеличении этих показателей в растущей бактериальной культуре можно вычислить константу скорости деления клеток (ее выражают числом удвоений концентрации бактерий за 1 час) и обратную ей величину – время генерации (интервал времени, за который число клеток удваивается).

3.1 Методы определения числа бактерий и бактериальной массы.

Во время роста периодической (статической, без смены среды) бактериальной культуры может не быть строгой пропорциональности между увеличением числа клеток и увеличением бакмассы. Поэтому показатели эти необходимо различать.

Определение числа бактерий. В популяции бактерий не все клетки жизнеспособны. Живыми считаются те клетки, которые могут образовывать колонии на/или в/ агаризированной среде, либо суспензию в питательном растворе. Эти жизнесособные клетки выявляют специальными методами, предназначенными для определения числа живых клеток. В общее же число клеток, входят также мертвые или поврежденные клетки.

Общее число клеток. Самыми распространенными методами определения общего числа клеток являются: подсчет под микроскопом в тонком слое «счетной камеры», применение электронного счетчика («счетчик Каултера»), нефелометрия (спектрофотометрия) и использование оптических стандартов мутности.

Число живых клеток. Обычно подсчитывают число колоний, образуемых жизнеспособными клетками в благоприятных для роста условиях. Существует несколько вариантов метода посева микробов в агар и подсчета числа колоний: а) посев в расплавленный агар на чашки Петри; б) посев на поверхность агара; в) посев в тонком слое агара; г) посев в многослойный агар.

Для этой цели можно использовать и метод мембранных фильтров. Профильтровав определенный объем разбавленной культуры через стерильный мембранный фильтр, затем его перегонят на агар или фильтровальную бумагу, пропитанную питательной средой, инкубируют их и подсчитывают число взросших колоний.

Определение бактериальной массы. Для оценки урожая обычно взвешивают сырые или сухие отцентрифугированные клетки. При определении интенсивности обмена или ферментативной активности исходят из содержания в клетках белка или азота. Часто выбор метода диктуется такими соображениями как простота или быстрота работы. В повседневной практике предпочтение отдается не прямым, а косвенным методам.

Прямые методы. Основаны на определении сырой или сухой биомассы, общего азота (метод микро-Кьельдаля и микродиффузионный). Общего содержания углерода, бактериального белка. Хорошие результаты дают модификации биуретового метода и другие колориметрические методы. Микрометоды основаны на измерении количества характерных компонентов белка: тирозина, триптофана (по Лоури или Фолину).

Косвенные методы определения бактериальной массы основаны либо на измерении мутности клеточной суспензии (измерение экстинции, турбидиметрия, нефелометрия), либо на определении показателей интенсивности метаболизма, непосредственно связанное с ростом (поглощение О₂, образование СО₂, или кислот), которые могут служить адекватной мерой бактериальной массы. К такого рода определениям прибегают в тех случаях, когда другие методы оказываются непригодными, например, при очень малой плотности клеточной суспензии. Для измерения можно применять титрометрические, электрохимические и другие методы. Выбор метода определения числа бактерий и бактериальной массы нередко зависит от того, с какой целью это определение производится и насколько точную характеристику роста микробной популяции необходимо получить.