2. Осаждение белков при изменении pH среды.

В пробирки вносят растворы в количествах, указанных в табл. 1.3.

Таблица 1.3

№ п/п	Раствор белка, см3	H2O, см3	0,1 н HCl, см3	Кратность разведения исходного раствора	Показание ФЭКа	Содержание белка, мг/см3
1	5	5	0
2	5	3	2
3	5	2	3
4	5	1	4
5	5	0	5

В пробирки с раствором белка вначале вносят заданное количество соляной кислоты, содержимое пробирок встряхивают и оставляют на несколько минут для формирования осадка. Затем вносят необходимое количество воды для компенсации объёма. Пробирки повторно встряхивают, и содержимое фильтруют через сухой фильтр. В фильтрате определяют белок по Лоури. Полученные данные вносят в таблицу и по ним строят график. При необходимости фильтрат предварительно разводят водой в 5 или 10 раз.

Лабораторная работа 3. Экстракция, выделение и очистка белков от примесей гель-фильтрацией на сефадексе g-50.

Метод гель-хроматографии проводится в виде колоночной хроматографии. В качестве геля используют препараты сефадексов – производных полисахарид декстрана, полученного путём сшивания его цепей поперечными связями 1:6.

Марки сефадексов G – 10, 15, 25, 50, 75, 100, 200 различаются степенью сшивания поперечными связями и связанной с ней способностью к поглощению воды, также размерами пор в гранулах.

Принцип работы сефадекса. Колонка, заполненная предварительно набухшим гелем сефадекса, содержит 2 вида объёмов жидкости: внутренний (V_вн.), заполняющий гранулы сефадекса и свободный (V_cв.), заполняющий пространство между гранулами. Общий объём колонки (V_общ.) равен сумме внутреннего и свободного объёмов.

V_общ.= V_вн. + V_св.

При пропускании смеси веществ через колонку крупные молекулы, превышающие по своим размерам поры гранул, размещаются между гранулами в свободном объёме. Молекулы меньшего размера проникают через поры внутрь гранул и располагаются как в свободном, так и во внутреннем объёме.

Объём элюата, с которым вещество выходит с колонки (V_эл.), зависит от распределения вещества между V_св. и V_вн.

V_эл.=V_св. + kV_вн.

где k – коэффициент распределения; k=V_эл. – V_св. / V_бщ. – V_св.

1. Вещества, для которых k=0, совершенно не проникают в гранулы геля и выходят с колонки со свободным объёмом: V_эл. = V_св.

2. Вещества, для которых k=1, равномерно распределяются внутри и вне гранул и выходят с колонки с V_общ.: V_эл. = V_св. + 1 V_вн. = V_общ.

3. Вещества, для которых 0 < k < 1, лишь частично проникают в гранулы и извлекаются с объёмом элюции большим свободного и меньшим общего объёма колонки.

V_св. < V_эл. < V_общ.

Разделение веществ происходит в объёме: V_общ. – V_св.

Такое разделение наблюдается только в том случае, когда сефадекс по отношению к разделяемым веществам является нейтральной матрицей, т.е не взаимодействует с ними. В тех случаях, когда разделяемые вещества взаимодействуют с матрицей (сорбция, ионные силы и т.д.), как например ароматические соединения, они задерживаются на колонке и выходят с объёмом элюции, который больше общего объёма колонки.

Таким образом, сефадекс работает как «молекулярное сито», фракционируя вещества по молекулярной массе.

Сефадексы применяют:

• для обессоливания (т.е. отделения высокомолекулярных соединений от низкомолекулярных);

• для смены буфера;

• для разделения высокомолекулярных соединений (белков, углеводов) с различной молекулярной массой;

• для определения молекулярной массы;

• для концентрирования растворов высокомолекулярных соединений, основанное на способности сефадексов к набуханию.