Конспект лекций

Для усиления роста и размножения используют метод не только поверхностного, но и метод глубинного культивирования. Если есть необходимость, то этот метод может быть использован при непрерывном аэрировании и перемешивании. Наиболее простой способ аэрирования – это встряхивание среды. Более эффективное аэрирование достигается при пропускании струи сильного воздуха через толщу питательной среды. Максимальное насыщение зависит от степени распыление воздуха. С этой целью воздух пропускают через толщу питательной среды через мелкопористые фильтры или тонкую ткань. Метод глубинного культивирования особенно распространен в биотехнологическом производстве, т.к. это более рациональное использование субстрата и получение большего количества продукта.

В промышленных целях культуры выращивают в специальных устройствах, именуемых ферментерами или реакторами. В эти сосуды помещается значительное количество питательной среды. Также используется аэрация. Именно глубинный метод нашел наиболее широкое производственное применение. Антибиотики, вакцины. При посеве бактерий в благоприятную жидкую питательную среду, при создании оптимальных условий, методом периодического (стационарного) культивирования. В таких условиях мы видим все фазы роста и развития микробной популяции.

Фазы роста

I-ЛАГ

I – ЛАГ. С момента посева бактерий в свежую питательную среду. Бактериальные клетки адаптируются к данным условиям культивирования. Клетки достигают максимальной скорости роста. При этом как абсолютная, так и удельная скорость роста увеличиваются от нуля до максимально возможных значений.

V = dx\dt,

где V – прирост биомассы, x – биомасса,

t – время.

Прирост биомассы выражается либо в весовых единицах, либо в числе клетках, либо в условных единицах. Удельная скорость роста:

M = dx\dt *1/x,

где М – прирост биомассы на единицу биомассы, х – начальная биомасса. Удельная скорость роста является наиболее важным показателем для

клетки и условий культивирования. Продолжительность ЛАГ зависит прежде всего от биологических особенностей. Кишечная палочка обладает коротким ЛАГ. Каринобактерии и

71

Микобактерии обладают более длительным ЛАГ. Кроме ого, продолжительность фазы зависит от возраста исходной культуры. Чем культура моложе, тем короче ЛАГ. Физиологически молодыми считают культуры, находящиеся в первых двух фазах роста и развития микробной популяции.

Если имеем дело с молодой культурой, то они как бы продолжают прерванную фазу роста и развития, быстро проходя начальные фазы. Причем, продолжают рост с прерванной скоростью роста. Старые культуры при пересеве на свежую среду, начинают рост и развития как бы с нуля. Увеличение посевной дозы бактерий при определенных условиях сопровождается уменьшением продолжительности ЛАГ фазы. При этом состав питательной среды существенно влияет на длительность этого периода. Чем ближе состав созданной нами среды к составу той среды, на которой культуру выращивали до пересева, тем короче ЛАГ фаза. Важную роль для длительности также играет температура культивирования бактерий, концентрация углекислого газа в среде и др. физ. и хим. показатели.

Иногда может наблюдаться наличие двух ЛАГ фаз. Обычно на средах, содержащих смесь питательных веществ, например смесь источников углерода. В основе данного явления лежит синтез новых ферментов, который индуцируется разными субстратами. В этой культуре происходит поочередное использование источников питания. Сначала используется один источник углерода, для чего были синтезированы свои ферменты, потом начинает использоваться другой. Впервые явление описано у кишечной палочки и получило название диауксия. В результате мы понимаем ступенчатый двухфазный вал или двухциклический рост. Например, у кишечной палочки из смеси глюкозы с сорбитом бактерия в первую очередь поглощает глюкозу, При этом начинает индуцироваться синтез ферментов, необходимых для глюкозы, а после использования всей глюкозы, начинает потребляться сорбит. Получается, что ЛАГ повторяется. Графически две загогулинки в первой фазе. Сопровождается увеличение бактериальной массы. Важным показателем, характеризующим эффективность использование субстрата или характеризующим продуктивность культуры в целом в конкретных условиях среды, является так называемый экономический коэффициент. Y = X/S1, где Y – экономический коэффициент, X – выросшая биомасса, S1 – количество потребленного субстрата. При этом X выражается в граммах сухой массы, либо в количестве клеток, тогда как количество потребленного субстрата выражается в ~~~~. Помимо упомянутого экономического коэффициента, используют другие.

II-ЛОГ

II-ЛОГ (экспоненциальная, логарифмическая). Характеризуется максимальной скоростью деления бактерий. Нарастание клеток идет в геометрической прогрессии, а это означает, что из одной клетки образуется две, потом четыре, а после n генераций количество клеток будет составлять 2n. На практике мы имеем дело с поколением бактерий более чем из одной клетки, следовательно, общее число бактерий в экспериментальных условиях будет вычисляться по следующей формуле:

N = N0*2n,

где n – число поколений,

N – общее количество клеток в конце эксперимента, N0 – количество клеток в начале эксперимента.

Но на самом деле в микробиологической практики для выражения общего числа клеток чаще пользуются не этими колоссальными абсолютными числами, а используют их логарифм.

n = (lg N – lg N0 )/lg 2;

N = 3,3 (Схуяли???)lg N/ N0.

g = t/n (период генерации), t – время эксперимента,

n – число поколений.

72

g = t lg2/ lgN – lgN0.

Для вычисления скорости деления одной клетки экспериментатору необходимо знать количество клеток в начале и в конце опыта, плюс необходимо знать время проведения эксперимента. При этом скорость генерации одной клетки находится в обратной зависимости к интенсивности процесса размножения. Чем интенсивнее процессы размножения, тем меньше значение скорости размножение отдельной клетки. Этим методом пользуются при сравнительном анализе характера действия различных факторов.

Все уравнения основаны на том допущении, что в ЛОГ фазе все 100% клеток бактерий остаются жизнеспособными. Но уже давно было установлено, что уже в ЛОГ фазе отмирает около 20% клеток. Поэтому, во все наши формулы нужно ввести поправку и вместо lg2 ставить значение 1,6. В целом экспоненциальный рост популяции описывается следующим уравнением:

X = X0eMmax t

X и X0 – количество клеток в конце и в начале эксперимента, E – основании натурального логарифма,

Mmax – максимальная удельная скорость роста, t – традиционно время эксперимента.

В экспоненциальной фазе процессы роста протекают сбалансированно, т.е. удвоение биомассы сопровождается удвоением количества белка, ДНК, РНК и других составляющих, но такая сбалансированность осуществляется в относительно короткий период времени. Эта фаза многостадийна, потому что в начале ЛОГ бактерии растут в среде с избытком субстрата, тогда как к концу ЛОГ концентрация субстрата понижается, в начале и в конце ЛОГ изменяется активность ферментов, возрастает в среде содержание метаболитов бактерий, кроме того, на рост бактерий в ЛОГ фазе оказывают влияние многие другие факторы. Как и в предыдущем случае, оказывают влияние видовые особенности бактерий. Например, Дифтерия делится каждые 34 минуты, клубеньковые бактерии делятся 90 минут. На рост бактерий в ЛОГ оказывает влияние характер питательной среды. У некоторых видов Азотобактера длительность периода генерации при выращивании культуры на минеральной среде с сахаром составляет 240 минут. Если тот же самый вид растить на бульоне с глюкозой, период генерации составляет 27-39 минут. Помимо этого, на рост бактерий в ЛОГ оказывает влияние отдельных компонентов среды. Например, период генерации у брюшно-тифозной палочки в среде с однопроцентным содержанием пептона будет 40 минут, а когда содержание падает до 0,125%, период генерации увеличивается от 40 минут до 800 минут. Кроме того, на рост бактерий влияет температура культивирования. Например, у Коли при повышении температуры от 5,5 до 42 градусов Цельсия, скорость деления возрастает от 5 суток до 20 минут. Но начиная с 42 градусов Цельсия период генерации опять уменьшается. Кроме того, у бактерий наблюдается несколько температурных оптимумов. Для роста клеток, для размножения, для активации биосинтетических процессов.

III – линейный рост и отрицательное ускорение

III – линейный рост и фаза отрицательного ускорения. Фаза замедленного роста. Эта фаза характеризуется в период роста линейного, постоянной скорость прироста биомассы или числа клеток, в результате может быть выражена следующим, уже хорошо известным уравнением, но чтобы подчеркнуть, что мы характеризуем не первую фазу, а ведем разговор о третьей фазе, это же уравнение имеет другой итог.

K = dx/dt.

K – константа скорости прироста биомассы или числа клеток, x – величина биомассы или число клеток,

t – время эксперимента.

73

Линейный рост сменяется фазой отрицательного ускорения роста. На этом кусочке численность делящихся клеток уменьшается. Вот эту фазу объясняют прежде всего тем, что в среде происходят качественные изменения, а именно мы наблюдаем качественные изменения состава питательной среды, поскольку в большом количестве необходимые питательные вещества уже были потреблены, с другой стороны, за первые периоды уже произошло накопление продуктов метаболизма микробной популяции. Кроме того, под влиянием продуктов метаболизма, изменилась рН среды. Помимо этого, если бы мы выращивали аэробные формы бактерий, изменилось содержание молекулярного кислорода в среде, изменился целый ряд других показателей среды. Вполне понятно, что бактериальная клетка реагирует на все эти процессы изменением интенсивности синтеза белка, изменением интенсивности синтеза полисахаридов, изменением интенсивности синтеза РНК и других компонентов клетки. Поэтому естественно, что клетка реагирует на истощение среды. При этом под истощением питательной среды понимают не дефицит общеупотребляемых для бактерий питательных веществ, а уменьшение или исчезновение специфических для данного вида бактерий веществ. Например, после выращивания на мясопептонном бульоне Коли или Стафилококус ауреус мы сеем культуру того же вида и пересев не будет сопровождаться существенным ростом новой популяции, т.к. все украдено до нас. А если посеем Сарцину флява, то будем наблюдать бурный рост популяции, потому что первозасеянные потребили свои уникальные элементы, но в среде остались элементы для Флявы. Кроме того, уже в этой фазе замедленного роста происходит отмирание и даже лизис части бактериальной популяции, т.е. прирост сокращается и часть активно отмирает.

IV – стационарная фаза

IV – стационарная фаза роста. Равновесие между погибающими и вновь образующимися клетками. Те факторы, которые лимитировали рост бактерий в предыдущей фазе, являются причиной возникновения стационарной фазы. Зато именно в стационарной фазе наблюдается максимальная величина биомассы, а также максимальная суммарная численность клеток. Именно эти максимальные величины называют урожаем или выходом. Также необходимо подчеркнуть, что одним из ограничивающих факторов этого накопления, является максимальная концентрация клеток в единице объема питательной среды. А эта максимальная концентрация клеток в единице объема, именуется максимальной плотностью упаковки биомассы. Эта максимальная плотность упаковки определяется объемом клеток и их пространственным расположением в питательной среде. У разных видов бактерий максимальное количество клеток даже в одном миллилитре питательной среды существенно варьирует. Для коли максимальная плотность упаковки биомассы в 1 мл составляет 1,5 млрд клеток, тогда как для Шигеллы дезинтерия в 1 мл содержится 0,3 млрд клеток. Кроме того, стационарная фаза у различных бактерий наступает через разные промежутки времени. Важно подчеркнуть, что в стационарной фазе клетки однозначно характеризуются несбалансированным ростом, т.к. разные клеточные компоненты синтезируются с различной скоростью. Кроме того, в стационарной фазе клетки характеризуются уменьшением интенсивности обменных процессов. В этот период бактериальные клетки характеризуются более высокой устойчивостью к физическим и химическим воздействиям.

V – фаза отмирания

V- фаза отмирания. Уменьшение числа живых клеток. Возрастание гетерогенности популяции. Т.е. кроме живых и мертвых клеток появляются клетки «тени». Они должным образом не воспринимают краситель. Они еще сохраняют свою структуру, но краситель уже не воспринимают. Представляют по сути инвалюционные формы. Можно наблюдать клетки со

74

слабым развитием муреинового слоя, с фибриллярностью цитоплазмы, клетки, в которых отслаивается клеточная стенка. Характерна не компактность нуклеоида, может быть характерна вакуолизация. Поле боя. Куча мертвых и раненых. Первые четыре фазы изучены лучше, последние две изучены хуже.

VI – фаза выживания

VI – фаза выживания. Наличие отдельных клеток, которые сохранились в течение длительного времени, при том, что произошла массовая гибель большей части микробной популяции. Если взять их и посадить на свежую среду, то после соответствующего ЛАГ, эти выжившие клетки интенсивно растут и делятся. Выживающие клетки должны иметь отличительные особенности, которые позволяют им выжить. Мы знаем, что они характеризуются низкой интенсивностью процессов метаболизма, более сильным светопреломлением, изменением ультраструктуры. Характерна мелкозернистая цитоплазма, отсутствие полирибосом и некоторые другие особенности. В итоге, кривая роста и развития микробной популяции описывает зависимость прежде всего логарифмов числа клеток от времени эксперимента. Такая кривая отражает процессы, характерные для периодической культуры, которая развивается в замкнутом жизненном пространстве без добавления питательных веществ и без удаления продуктов метаболизма.

Помимо периодического культивирования, биотехнологи используют непрерывные культуры и метод непрерывного культивирования. Метод состоит в том, что в реактор все время поступает свежая питательные среда и одновременно с той же скоростью выводится культуральная жидкость, которая содержит бактериальные клетки и продукты метаболизма. Регулируя скорость протока среды, мы управляем ростом бактериальной популяции. Скоростью протока мы можем удлинять ЛОГ, фазу стационарного роста на любое нужное нам время. Непрерывное культивирование осуществляется в специальных приборах – хемостат или турбидостат.

Хемостат

В хемостате рост бактерий регулируется концентрацией субстрата, т.е. поддерживая постоянную концентрацию одного из необходимых субстратов, чаще всего это либо источник углерода или источник азота, путем регулирования скорости протока среды можно стабилизировать скорость роста культуры бактерий. При больших скоростях скорости протока среды, рост культуры приближается к максимальному, но при этом бактерии быстро вымываются. Это происходит, когда коэффициент разбавление превышает удельную скорость роста. Исходя из этого скорость изменение числа клеток в хемостате определяют по уравнению. dX/dt = mX – Dx = dx/dt = x(m-D), где x – исходная растущая биомасса, m – удельная скорость роста, D – коэффициент разбавления, t – время, dx/dt – скорость прироста биомассы.

Исходя из данного уравнения мы можем вычислить скорость разбавления. D = F/V, где F – скорость протока среды (л/час), V – объем среды в реакторе. D выражает смену объемов среды за час. Таким образом, скорость изменения величины биомассы клеток в хемостате равна разности между скоростью прироста биомассы и скоростью выноса ее из культиватора.

Нас интересует постоянство плотности популяции. Плотность популяции остается постоянной, если m=D, т.е. если потеря клеток и прирост клеток в ходе размножения уравновешиваются.

75

Турбидостат

Турбидостат. Основан на регулировании скорости протока среды плотностью популяции. При этом плотность бактериальной популяции контролируется фотоэлементом, который соединен с реле, которое и регулирует подачу среды. Когда плотность достигнет заданного нами уровня, срабатывает реле и в культиватор поступает свежая питательная среда. И наоборот, да. Турбидостатный контроль может быть основан на других методах определения биомассы, либо на методах определения других продуктов, образующихся в ходе роста и развития. рН-статный контроль, оксистатный и т.д. Именно эти методы непрерывного культивирования микроорганизмов использовались и используются для изучения физиологии, биохимии, генетики и других особенностей микробов. Кроме того, метод непрерывного культивирования широко используется в промышленности. Разработаны варианты непрерывного культивирования, такие как продленная периодическая, многоциклическая, полунепрерывная и т.д.

Синхронные культуры

Для изучения синтеза отдельных клеточных компонентов, прежде всего в процессе деления бактериальных клеток, а также для цитогенетических и генетических исследований, активно были использованы и используют синхронные культуры.

Синхронные культуры – это культуры, в которых некоторое время все клетки делятся синхронно, т.е. одновременно. Происходит это за счет из одинаковой готовности к росту и делению. Подобная синхронизация достигается физическими и хемико-биологическими методами. К физическим методам относят температуру, дифференциальное центрифугирование, дифференциальное фильтрование, чередование световых и темновых режимов. Таким образом достигают синхронизации культуры, которые по сию пору используют в исследованиях.

76