Конспект лекций

шок у бактерий возникает каждый раз, когда бактерия пересекает градиент интенсивности света, а этот градиент отделяет ярко освещенное пятно от темной области вокруг него. Если экспериментальный препарат освещать светом, разложенным на спектр, то клетки будут скапливаться в полосах, соответствующих максимумам поглощения пигментных фотосинтезирующих систем бактерий.

Внутриклеточные структуры бактерий

Рибосомы

Рибосомы – частицы от 16 до 18 нм, которые состоят на 60-65% из РНК, а на 35-40% из белка. Рибосомы содержат от 80 до 85% всей РНК бактериальной клетки. При этом по аминокислотному составу белок рибосом прокариот сходен с гистонами рибосом эукариот. В нем отсутствует триптофан и серосодержащие аминокислоты.

Поскольку интактные бактериальные рибосомы осаждаются со скоростью 70$, их называют 70$ частицами. При концентрации 10-3 моль магния, частицы распадаются на две субъединицы. 30 и 50. 30$ содержит одну молекулу РНК и 21 молекулу белков, тогда как 50$ содержит две молекулы РНК, а так же чуть больше 40 молекул белка. Причем, большинство белков находятся в рибосоме в одной копии, но у 50$ имеются несколько копий всего двух белков.

Один из вариантов идентификации бактерий связан с анализом 16S РНК.

Бактериальная клетка содержит от 1500 до 50000 рибосом, причем, количество рибосом в одной бактериальной клетки меняется в течение ее развития. При этом скорость роста клетки определяется скоростью образования рибосом. В среднем, за каждую секунду у бактерий образуется около 5-10 рибосом. При этом большая часть рибосом у бактерий объединяется в полисомы, агрегаты, состоящие из рибосом, а также молекул матричной и транспортной РНК. Связаны либо с цитоплазматической мембраной, либо с мембранными структурами. У бактерий полисомы способны прикрепляться к веточкам матричной РНК, а молекулы матричной РНК способны присоединяться к молекулам ДНК. В результате формируются комплексы рибосома- мРНК-ДНК. Именно образование этих комплексов объясняется характерной для прокариот ассоциацией процессов транскрипции и трансляции.

Рибосомы бактерий являются местом синтеза белка, у Сережи тоже. В цитоплазме 80S, в митохондриях и хлоропластах 70$.

Мезосомы

Внутриклеточные мембранные образования, которые впервые были описаны у бацилл. По морфологическим особенностям различают ламеллярные (пластинчатые), везикулярные (пузырьки), а также тубулярные или трубчатые мезосомы. Достаточно часто наблюдают мезосомы смешанного типа, которые состоят из ламелл, трубочек, пузырьков. Кроме того, мезосомы могут образовывать сложные комплексы. При этом мезосомный комплекс ограничен инвагинацией цитоплазматической мембраны. Подобная инвагинация в большинстве случаев имеет мелководную форму. Этот мезосомный комплекс содержит ветвящиеся внутренние трубочки, пластинчатые мембранные элементы, а также содержит тесно закрученный в клубок трубчатый вырост. При этом трубчатый вырост, а также другие элементы мезосомы соединены с

61

наружной мембраной. Такой сложный комплекс может наблюдаться внутри бактериальной клетки.

Мезосомы также отличаются по их расположению в клетке. Они бывают периферические, ядреные, а также это мезосомы, формирующиеся у делящихся бактерий.

Периферические мезосомы образуются в результате инвагинации цитоплазматической мембраны. За их счет увеличивается поверхность цитоплазматической мембраны и мы не знаем, но полагаем, что цитоплазматические мезосомы, раз они увеличивают поверхность цитоплазматической мембраны, видимо, функционально, соответствуют ей.

Ядреные мезосомы (нуклеидосомы) соединены с нуклеоидом бактериальной клетки. Мы без понятия, что это за хуйня, но полагаем, что определяют расхождение дочерних хромосом после репликации.

Мезосомы, формирующиеся у делящихся бактерий. Формируются в зоне образования поперечной перегородки, причем, они могут формироваться либо с обеих сторон поперечной перегородки, либо только на стороне дочерней клетки. По мнению ряда ученых, только эти образования следует называть мезосомами.

Мезосомы рассматривают как участки проникновения в клетку трансформирующей ДНК, а также это участки прикрепления плазмид. Кроме того, считают, что мезосомы – это выделительный аппарат бактериальной клетки, а также мезосомы – это место синтеза экзоферментов.

Есть мнение, что мезосомы – это функционально инертные образования, которые возникают при появлении избытка мембранного материала. Более того, есть авторы, которые относятся к мезосомам как к артефактам, которые образуются только при специальной обработке.

Функциональная роль мезосом в структуре бактериальной клетки окончательно не изучена.

Хроматофоры

Из трех основных компонентов фотосинтетического аппарата два (фотохимические реакционные центры, фотосинтетические электронтранспортные системы) всегда расположены в цитоплазматической мембране или ее производных, а этими производными выступают хроматофоры или тилакоиды.

Третий компонент (светособирающие пигменты) могут находиться в разных местах, и именно у пурпурных бактерий в хроматофорах, у зеленых бактерий в хлоросомах, у цианобактерий эти пигменты концентрируются в фикобилисомах.

Фотохимические реакционные центры. В них происходит трансформация электромагнитной формы энергии в химическую.

Фотосинтетические электронтранспортные системы. Они обеспечивают перенос электронов, сопряженный с накопление энергии в макроэргических связях в АТФ.

Светособирающие пигменты. Они поглощают энергию света и передают ее в фотохимические реакционные центры.

Хроматофоры представляют собой внутриклеточные мембранные образования. При этом хроматофоры бывают разные. Они отличаются по форме, а также по расположению в бактериальной клетки. Они могу иметь форму трубочек и пузырьков. Диаметр в форме пузырьков от 20 до 100 нм. При этом они всегда образуют сложную мембранную сеть, которая связана с цитоплазматической мембраной. Такая связь прежде всего характерна для пурпурных бактерий (род Хроматиум). Кроме того, хроматофоры могут представлять собой систему трубочек, которые располагаются либо параллельными рядами, либо ветвятся. Они могут иметь вид сдвоенных

62

мембранных пластин, являющихся выростами мембраны. Более того, известны сдвоенные фотосинтетической мембраны, именуемые тилакоидами. При этом тилакоиды могут быть собраны в стопки, они могут располагаться параллельно. В результате, в отличие от хлоропластов, хроматофоры и тилакоиды бактерий могут исчезать в темноте. При освящении воскресают.

У почкующихся бактерий в почке они формируются заново. Они бывают хлоросомы и фикобилисомы.

Хлоросомы – это продолговатой формы структуры, длиной от 100 до 150 нм, которые окружены однослойной белковой мембраной. Эти продолговатые структуры прилегают к цитоплазматической мембране и именно в хлоросомах упорядоченно упакованные молекулы Бактериохлорофиллов.

Фикобилисомы – полусферические или палочковидные гранулы, которые правильными рядами располагаются на поверхности, причем, на внешней поверхности фотосинтетических мембран. Они содержат водорастворимые пигменты белковой природы. Эти водорастворимые пигменты белковой природы носят название фикобилипротеиды.

Карбоксисомы

Другое название – полиэдральные тела бактерий. Были обнаружены прежде всего в клетках цианобактерий, у некоторых пурпурных бактерий, а также среди представителей хемолитоавтотрофов (тиобациллы, нитрифицирующие бактерии). Карбоксисомы представляют собой четырех или шестигранные включения, которые окружены однослойной белковой мембраной и внутри себя они содержат ключевой момент фиксации CO2 в цикле Кальвина – рибулоза дифосфат карбоксилаза.

Функции карбоксисом пока до конца не ясны. Карбоксисомы не обязательны даже для тех бактериальных клеток, которые относят к анаэробным фототрофам и даже к хемолитоавтотрофам.

Аэросомы

Характерны для водных бактерий, особенно для пурпурных и для зеленых серобактерий. Например, род Pelodicryon. Помимо этого, газовые вакуоли характерны для обитателей илов, прежде всего это архебактерии, например, представители рода Methanosarcina. Кроме того, отдельные представители почвенных бактерий имеют аэросомы в своей структуре. Они состоят из газовых пузырьков, которые располагаются параллельными рядами, в результате формируется сотоподобная структура. У некоторых клостридии аэросомы образуют своеобразные колпачки на спорах. Газовые пузырьки как основа аэросом представляют собой полые цилиндры с коническими концами длиной от 200 до 1000 нм, которые окружены однослойной белковой мембраной, в которой гидрофобные аминокислоты обращены внутрь цилиндра, а гидрофильные – наружу. Такое расположение препятствует проникновению воды в пузырек. Состав газа внутри пузырьков идентичен составу газа окружающей среды. При этом важно помнить, что бактериальная клетка воспроизводит газовые вакуоли только путем образования этих структур заново.

Аэросомы являются регуляторами плавучести бактерий. Именно аэросомы позволяют бактериям, которые лишены жгутиков, осуществлять движение в открытых водоемах и капиллярах почвы вертикально. Такое вертикальное перемещение позволяет занять свою нишу, наиболее благоприятную их существованию, относительно концентрации растворенного

63

кислорода, относительно источника питания и в том числе относительно источника света. Т.е. газовые вакуоли имеют для клетки приспособительное значение.

Магнетосомы

Обнаружены в клетках бактерий, обладающих магнетотаксисом. За счет этих структур они плывут вдоль линии магнитного поля земли. Эти частицы обладают оксидом железа Fe3O4. Эти частицы окружены мембраной. В результате они имеют разную форму. Они различаются по количеству, также отличаются по расположению магнетосом в клетке. Классическим объектом исследования магнетосом являются Aquaspirillum magnetotactium. Именно у них в клетках магнетосомы изучены наиболее полно. У них располагаются в цепочках вдоль оси клетки, имеют форму куба и вообще стандартные.

Цитоплазматические включения

Полифосфаты (валютин, метахроматин) широко распространены. Представлены среди уксусно-кислых, молочно-кислых, азотфиксирующих бактерий, актиномицет, спирилл, представителей др. групп. В неокрашенных живых клетках полифосфаты представляют собой округлые, диаметром до 1 мкм преломляющие свет зерна. Некоторые красители, например, метиленовый синий или тауидиновый синий при окрашивании гранул валютина изменяют свой синий цвет в фиолетово-красный. Называю валютином, потому что впервые включения обнаружены у Spirillum volutans. Можно дополнить, что метахроматиновые свойства обусловлены наличием больших количеств неорганического полифосфата. Кроме того, в них обнаруживаются примеси РНК, ДНК. При этом характер молекулярной организации полифосфата в гранулах валютина до конца мы не знаем. Валютин может составлять до 20% общего объема клетки. Мы используем наши знания в диагностике целого ряда болезней. У дифтерии зерна крупные, хорошо видные в микроскоп, располагаются по полюсам клетки. Тела Бабеша-Эрнста. Валютин мы рассматриваем как внутриклеточный резерв фосфора. Кроме того, мы знаем, что полифосфаты богаты макроэргическими связями, поэтому валютин может выступать еще одним источником энергии.

Включения серы. Характерны для пурпурных серобактерий. Они используют сероводород как донор электронов при фотосинтезе. Кроме того, включения серы встречаются у нитиевидных нефотосинтезирующих серобактерий. Они окисляют сероводород и сера является источником энергии. Сера накапливается тогда, когда в среде содержится сероводород. В случае, когда весь сероводород среды исчерпан, эти включения окисляются до сульфата. При этом включения серы располагаются в инвагинатах цитоплазматической мембраны.

Включения карбоната кальция. Известковые тельца. Обнаружены в клетках некоторых серобактерий, при том, что физиологическое значение нам не известно совсем. Предполагают, что они выполняют функцию нейтрализации среды, соединяясь с серной кислотой, которая в свою очередь образуются при окислении внутриклеточной серы. Потом все это безобразие диффундирует.

Кристаллоподобные включения. Их называют параспоральными включениями, поскольку в бактериальной клетке они располагаются рядом со спорой. Также их именуют предспоровыми включениями, т.к. они формируются в период, предшествующий эндоспорообразованию. Имеют белковую природу. По форме они бывают ромбовидными, кубическими. Сильно преломляют свет, очень хорошо окрашиваются как основными, так и кислыми красками. Они высокотоксичны в отношении организмов гусениц (о_О) Освобождаясь

64

из бактериальной клетки, белковый кристаллик попадает на поверхность растений, а с поверхности растений проникает в кишки чешуекрылых. В щелочном содержимом гусениц, кристаллик растворяется, вызывая разрыхление эпителия стенки кишок у гусениц. Происходит диффузия жидкости кишок в кровь и развивается паралич кишок. При этом кристаллоподобные включения бацилл не токсичны для позвонцов и бактерий, поэтому бактерии рассматриваются как средство биологической борьбы.

R-тельца. В свое время были обнаружены у рода Caedbacter. Симбионты инфузорийпарамеций. Именно эти бактерии придают инфузориям способность убивать клетки парамеций, которые подобных включений лишены. Гибель происходит в результате заглатывания инфузориями R-тел, которые освобождаются в среду инфицированными животными (Что???). R- тела – светопреломляющие тела блядь. Имеют белковую природу. Морфологически имеют вид плотно скрученной ленты. За формирование этих тел ответственны плазмидные гены бактерий. В популяции бактерий только часть клеток образуют R-тела, ибо те, кто образует, теряют способность делиться. Капитализм. Они были найдены также у водородокисляющих бактерий рода Псевдомонас.

Рост и размножение бактерий

Рост микроорганизмов

«Рост – это увеличение биомассы клетки». Но не всякое увеличение биомассы клетки может рассматривается как рост. Например, у азотобактера увеличение биомассы очень часто происходит за счет ослизнения культуры. И это таки не рост.

Бактерии в оптимальной среде, к которой они адаптировались, находятся в состоянии сбалансированного роста. Когда удвоение биомассы клетки сопровождается удвоением количества белка, ДНК, РНК и др. С учетом этого рост может быть определен как согласованное увеличение количество всех химических элементов клетки. При этом рост бактерий происходит в результате множества различных взаимосвязанных биохимических реакций, которые осуществляют синтез клеточного материала. В результате мы у бактерий сталкиваемся с двумя понятиями роста. Оно – индивидуальный рост бактериальной клетки. Другое – в популяциях

Индивидуальный рост бактерий. О нем судят по увеличению размеров отдельных особей, которые располагаются изолированно или небольшими группами в тонком слое питательного агара, либо располагающаяся в препарате висячая капля. Существуют прямые и косвенные методы измерения размеров. Прямым методом является измерение размеров клеток с помощью окулярных микрометодов. Косвенным методом выступает измерение негативных изображений – микрофотографий. Ошибка обоих методов измерения от 10 до 15%. Таким образом, мы можем измерить как минимум длину и ширину индивидуальной бактериальной клетки.

Оценка объема цилиндрической формуле с закругленными концами:

V = 2ab^2(a+2\3b),

где а – половина ширины, b - половина длины.

Для цилиндрических клеток с плоскими концами:

V= 2ab^2.

Есть сферические клетки:

V = 4\3ПИr^2.

Встречаются еще элипсоидные:

65

V =4\3ab^2.

Скорость роста бактерий при этом зависит от внешних условий и от физиологического состояния самой клетки. При постоянных условиях рост бактериальной клетки осуществляется с постоянной скоростью. Математически, такой сбалансированный рост выражается в законе органического роста.

Объем растущего тела в конкретный момент времени вычисляется по формуле: V = V^c e^t,

где V – объем растущего тела, с – константная скорость роста,

е – основания натурального логарифма, t – время.

Рост тела, меняющегося в своих размерах как экспоненциальная функция, называют экспоненциальным ростом. Он может происходить только при постоянстве условий существования. Но в стационарных культурах условия меняются. Меняются свойства, физиологическое состояние клеток. Поэтому скорость роста константой не остается. И, тем не менее, для небольшого промежутка времени условия можно считать постоянными и применять этот закон. На самом деле, это период генерации. Рост палочек и рост шариков отличается друг от друга. Палочки растут в длину, поэтому соотношение между поверхностью клетки и ее объемом при таком росте бактериальной клетки существенно не меняется. Получается, что условия могут считаться постоянными. Шарики растут одновременно во всех направлениях. Прежде всего увеличиваются размеры радиуса клетки. При этом относительная величина поверхности клетки падает, поскольку поверхность возрастает пропорционально квадрату радиуса, а объем – пропорционально кубу радиуса. Таким образом, условия снабжения каждой части шаровидной клетки по мере увеличения ее размеров становится все более и более неблагоприятными. Поэтому, если при росте палочек мы можем использовать понятие экспоненциального роста, а при росте шариков мы говорим об угасающем экспоненциальном росте. Количественная характеристика размеров или объемов клеток позволяет судить об интенсивности роста. Так, в промежутки между делениями клеток, клетки имеют большие размеры, чем после деления.

При росте бактерий в бактериальной популяции происходит три взаимосвязанных процесса. Это индивидуальный рост клеток, размножение бактерий и отмирание клеток.

Рост можно определить как координированную репликацию всех структур, органелл и компонентов клеток, которая, как правило, заканчивается размножением клеток в бактериальной популяции. В свете этого возникает понимание размножения бактерий. Наиболее часто бактерии размножаются путем простого бинарного деления, когда из одной бактериальной клетки образуются две, каждая из которых в свое время делится, причем процессу деления всегда предшествует репликация ДНК.

Существует два типа бинарного деления: перетяжка и поперечная перегородка.

Деление перетяжкой. Синоним – констрикция. Сопровождается сужением клетки в месте ее деления, причем, в этом процессе принимают участие все слои клеточных оболочек, т.е. происходит впячивание оболочек с обеих сторон внутрь клетки. В результате клетка все больше и больше сужается, наконец она делится надвое. Констрикция свойствена многим Гр-, тогда как деление с образованием поперечной перегородки преимущественно у Гр+. У некоторых групп микроорганизмов отличают смену способов деления, например у Микобактерий, у Тионовых бактерий и пр. При этом период от деления до деления представляет собой онтогенез бактерий и это период носит название клеточного цикла бактерий.

66

Клеточный цикл бактерий

У бактерий различают несколько типов вегетативного клеточного цикла:

1)Мономорфный. Образуется только один морфологический тип клеток. Данный тип вегетативного клеточного цикла присущ бациллам, некоторым энтеробактериям и целому ряду других.

2)Диморфный. При нем возникают два морфологических типа бактерий. Присущ представителям рода Каулобактер.

3)Полиморфный. При этом образуются несколько морфологически различных типов клеток, причем, каждый из этих типов характеризуется определенными и постоянными особенностями клеточного цикла. Присущ актиномицетам, а также Артробактерам.

Как правило, при мономорфном цикле деление клеток происходит в плоскости, перпендикулярной длины оси клетки. Например, у некоторых бактерий обычные деления чередуются с продольными. Такое чередование характерно для бактерий рода Пелодикрион.

У шаровидных бактерий может образовываться не одна поперечная перегородка, а несколько. Это важно, потому что если возникает одна перегородка, то клетка делится в одной плоскости. Тогда образуются микрококки, диплококки, а также стрептококки. Если формируются две перегородки, причем, они располагаются в двух взаимноперпендикулярных плоскостях. Тогда образуются тетракокки. При расположении перегородок в трех взаимоперпендикулярных плоскостях образуются скопления клеток в виде сарцин.

Все эти способы закладки перегородок являются наследственно закрепленными, следовательно, они используются в систематики.

При делении бактерий с образованием поперечной перегородки, вместе с клеточной стенкой врастает внутрь клетки и сама цитоплазматическая мембрана. При этом инвагинаты постепенно снижаются и в результате соединяются, поэтому стартово образовавшаяся перегородка расщепляется. Расщепление клеточной перегородки у разных бактерий происходит по-разному. Расщепление клеточной перегородки может происходить по мере ее роста, так происходит у стрептококков. Либо расщепление клеточной перегородки может происходить быстро , толчком в конце деления. Это характерно для стафилококков. При этом расщепление поперечной перегородки может быть полным, тогда все дочерние клетки расходятся друг от друга. Оно может быть не полным, клетки остаются связанными друг с другом.

Механизмы деления

Механизмы, приводящие к расщеплению клеточных перегородок и приводящие к расхождению дочерних клеток до конца не ясны.

Протолитические ферменты

Мы знаем, что у ряда бактерий, например у кокковых форм деление связано с активностью литических ферментов, которые надрезают клеточную стенку. При этом в месте разреза постепенно растет новая клеточная стенка, которая раздвигает материнскую клеточную стенку и частично образует подстилающий ее слой. Также у ряда кокковых форм деление связано все с теми же ферментами, но обуславливают они не процесс надрезания клеточной стенки, а работают по слущиванию. В этом процессе литические ферменты отделяют внешний, старый слой стенки от внутреннего молодого, затем в работу вступают дезинтегрирующие литические ферменты, которые растворяют слущенный слой. На этом этапе, при растворении слущенного слоя на поверхности клеточной стенки бактерий нередко формируется структура, именуемая шрамом. Он

67

формируется на границе старой и новой клеточной стенки. Последними в работу вступают ферменты, которые расщепляют перегородку полностью.

Врастание и расщепление перегородок

Клетки также делятся за счет врастания и расщепления перегородок, но синтез муреина у них происходит по всей внутренней поверхности оболочки. При этом новосинтезированный муреин постепенно включается в слой старого муреина. Такой рост именуют диффузным ростом оболочки. Поэтому, в результате исключительно из нового муреина у бацилл состоит только перегородка. Это мы вспомнили только мономорфный цикл.

При диморфном и полиморфном клеточных циклах различают дочерние и материнские клетки. Так например дочерние клетки стебельковых бактерий подвижны, имею полярный жгутик, у них есть фимбрии. Кроме того, они характеризуются наличием специального периода, в который происходит образование стебелька. При этом они не способны к делению, пока этот стебелек не образуется. По сути, формирование стебелька – граница между дочерней клеткой и материнской, потому что появление стебелька сопровождается потерей жгутика, причем, жгутик сбрасывается с клетки вместе с крючком и стержнем. В результате, в отличие от дочерних клеток, материнские клетки неподвижны, они имеют стебелек и также способны к делению.

Почкование

У бактерий почкование является разновидностью бинарного деления. Этот способ размножения присущ бактериям, имеющим диморфные, а также полиморфные вегетативные клеточные циклы. Например, он присущ бактериям рода Гифомикробиум, Родомикробиум, Нитробактер. У некоторых бактерий почкование мало отличается от простого бинарного деления, например у Нитробактеров. У других бактерий из клетки вырастает от одной до четырех, а иногда и более нитей, которые традиционно именуются гифами. На конце этих гиф образуется своеобразное вздутие, которое представляет собой дочернюю клетку или почку. Дочерние клетки формируют жгутик и отделяются от материнской клетки. В этом случае между почкой и гифой образуется перегородка. Либо такая перегородка не образуется и дочерние клетки образуются связаны с материнской клеткой. Обычно материнская клетка дает до четырех дочерних клеток, после чего в большинстве случаев отмирает. Почкующимся бактериям присуща полярность клеток. Обычно рост клетки после каждого деления происходит со стороны одного и того же полюса в одном и том же направлении. Плюс к этому, почкующимся бактериям присуща асимметрия внутри клеточных структур. Обычно почкующимся бактериям присуще наличие шрамов. Так, при полиморфном вегетативном клеточном цикле у кокков новые шрамы располагаются на поверхности клетки перпендикулярно старому шраму. В результате старый шрам распадается на два фрагмента. Получается, что на каждую из дочерних клеток приходится по одному фрагменту старого шрама. В этом случае у кокков каждая из дочерних клеток получает полусферу материнской клетки со старым шрамом и полусферу вновь синтезированной оболочки. У палочковидных форм бактерий наблюдается однонаправленный рост оболочки с одновременным расщеплением перегородки.

68

Споры

Плюс к этому, бактерии могут размножаться с помощью спор. Споры у бактерий представляют собой фрагмент гиф. За счет этих спор происходит размножение Актиномицетов. Кроме того, для бактерий характерна очень высокая скорость размножения. Например, при благоприятных условиях кишечная палочка делится каждые 20-30 минут. За сутки из одной клетки Коли формируется 472*10^19 клеток за сутки. Это 2^72. Если принять, что 1 млрд сухой массы бактериальных клеток имеет массу одного миллиграмма, то это безумное количество будет иметь массу 4720 тонн. Это результат работы ОДНОЙ Коли за сутки. Так бы развивались события в условиях, исключающих гибель бактерий. Высокая скорость размножения бактерий обеспечивает их сохранность на Земле, даже в условиях массовой гибели. При этом даже единичные сохранившиеся отдельные клетки бактерий размножаются вновь и дают новое поколение.

Рост бактерий в бактериальных популяциях

Популяция – совокупность бактерий одного вида (чистая культура) или совокупность разных видов бактерий, развивающихся в одном ограниченном пространстве (питательная среда).

Вбактериальной популяции постоянно одновременно происходит три процесса: рост бактерий, их размножение и отмирание клеток. Поэтому, для наблюдения за развитием бактериальной популяции надо знать численность как жизнеспособных, так и мертвых клеток, а также биомассу этих клеток. Для этой цели используются прямые и косвенные методы исследования. С помощью прямых методов подсчитывают общее количество клеток в популяции или определяют суммарную сухую массу в определенном объеме питательной среды. При этом подсчет численности клеток осуществляют в специальных счетных камерах под микроскопом. У него есть электронный счетчик, поэтому можно также использовать счетчик, который считает клетки на мембранных фильтрах. При подсчете численности учитываться могут и живые и мертвые клетки. Для определения только численности жизнеспособных клеток применяется высев бактериальной суспензии на плотные питательные среды с последующим подсчетом выросших колоний. При этом предполагается, что каждая колония бактерий образуется из одной бактериальной клетки. Но в действительности это не так. С этим связана объективная ошибка метода.

Т.к. размеры микроорганизмов очень малы, то при изучении отдельных индивидуумов мы получаем весьма ограниченную информацию о свойствах этих отдельных бактериальных клеток, поэтому микробиологи изучают микробные популяции, которые состоят из миллионов и даже миллиардов особей. Такие популяции именуются культурами. Их получают, выращивания микроорганизмы при тех или иных определенных, часто константных условиях. Культуру, содержащую микроорганизмы только одного вида, именуют чистой культурой, она же аксеническая культура, а культуру, в которой содержится более чем 1 вид микроорганизмов, именуют смешанной культурой. При этом если в культуре растут только два вида микроорганизмов и при этом их специально поддерживают в ассоциации друг с другом, такую культуру именуют двухкомпонентной.

Витоге, основу микробиологических методов составляют две процедуры:

1)Выделение, т.е. изоляция определенного микроорганизма из существующих в природе смешанных популяций;

2)Культивирование бактерий (выращивание микробной популяции в искусственной среде);

69

Метод накопительных культур позволяет выделять микроорганизмы с любой комбинацией потребностей в питательных веществах, если искомый тип вообще существует в природе. При этом метод накопительных культур очень прост. Для накопления всего-навсего нужны такие условия, при которых данный микроорганизм преодолевает конкуренцию. При этом подбираются разные факторы, которые создают определенные условия, дающие преимущества именно этому микроорганизму. Это целый комплекс факторов, например, источники энергии, источники углерода, источники азота, акцепторы электронов, состав атмосферы, освещенность, температура, рН и пр.

Для создания накопительных культур используют не только твердые, но и жидкие питательные среды. Например, частый пересев с жидкой среды на жидкую среду предотвращает рост сопутствующих микроорганизмов, которые могли бы использовать продукты метаболизма представителей этой культуры для своего роста.

Важную роль еще играет принцип элективности. Особенно легко создать элективные, они же избирательные условия для крайне специализированных микроорганизмов. Например, для цианобактерий, фиксирующих молекулярный азот, используется минеральная среда, не содержащая соединения азота. Растят бактерии на свету. Если эту же среду дополнить органическим источником энергии и углерода, то на ней в темноте в аэробных условиях будет развиваться азотобактер, а в анаэробных условиях на этой же среде будут развиваться клостридии. Для успешного получения накопительных культур следует ограничиться удовлетворением минимальных потребностей только того микроорганизма, который мы хотим вырастить. Например, если нужно выделить бактерии, способные окислять метанол или молекулярный водород в качестве акцепторов электронов, нужно исключить доступ в нашу экспериментальную среду молекулярного кислорода, иначе вместо анаэробных станут доминировать аэробные виды бактерий, которые окисляют метанол или водород.

Есть еще негативная селекция. На среде, содержащей озид, в присутствии молекулярного кислорода растут молочно-кислые бактерии, тогда как рост аэробных бактерий может подавляться.

Вмедицинской диагностике избирательным торможением роста пользуются для выявления, например, возбудителей дифтерии. Используют среду с телуритом. Для диагностики патогенных представителей семейства энтеробактерий используют агрезированные среды с висмутом. Есть метод применения пенициллина для отбора ауксотрофных мутантов. Кроме того, пенициллин для подавления роста микрофлоры.

Влюбом посевном материале могут присутствовать разные штаммы с одинаковым типом метаболизма. На твердых элективных средах штаммы, условия для которых благоприятны, образуют отдельные колонии. При достаточно большом расстоянии между колониями конкуренция за питательные вещества не имеет места.

Штаммы, растущие более медленно, не подавляются штаммами бактерий, растущими быстрее. Поэтому даже на одной питательной среде эти разные штаммы можно отделить друг от друга.

Чистую культуру выделяют как на твердых питательных средах, так и в жидких. Но при учете, что нужные микроорганизмы численно преобладают в исходных материалах. К сожалению, даже в эксперименте мы используем смешанные культуры, но они представляют собой смесь чистых культур микроорганизмов.

Исследования на смешанных культурах заданного состава позволяют нам понять, какими могут быть сложные форму взаимодействия микроорганизмов друг с другом в местах их естественного обитания.

Следующий важнейший вопрос – основные типы питательных сред и требования, которые

кним предъявляются.

70