Розділ 2

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для вирішення поставлених завдань нами був використаний комплекс фізіологічних, хірургічних, фармакологічних та біохімічних методів досліджень. Експерименти по дослідженню секреторної функції шлунка при алкогольному панкреатиті проведені на самках білих лабораторних щурів з вихідною масою 170-200г, а при хронічному некротичному панкреатиті – на самцях таких самих щурів з вихідною масою 190-200г. Тварини знаходилися на звичайному харчовому раціоні віварію, а перед дослідом добу голодували з вільним доступом до води.

Хронічний алкогольний панкреатит у щурів моделювали шляхом споживання тваринами 20% розчину етанолу в якості єдиного джерела пиття впродовж 14 тижнів (n=25) [ ]. Тварини контрольної групи споживали водопровідну воду без обмежень (n=20).

Хронічний некротичний панкреатит моделювали L-аргініном, застосовуючи його інтраперитоніально за наступною схемою. Перша ін’єкція амінокислоти з розрахунку 5 г/кг маси тіла тварини. Друге введення L-аргініну проводили на четверту добу, третє – на сьому, четверте – на десяту добу після першої ін’єкції амінокислоти; щоразу в дозі 2,5 г/кг маси тіла []. Шлункову секрецію досліджували методом аспірації на одних і тих самих тваринах на десяту (n=12) та шістдесят третю (n=6) доби після останнього введення L-аргініну. Контролем були спроби з внутрішньоочеревинним введенням тваринам фізіологічного розчину за відповідною схемою (n=18), поставлені на десяту та шістдесят третю доби після останньої ін’єкції.

Хронічні досліди проводили методом аспірації. Умови хронічного експерименту дозволяли досліджувати зміни шлункової секреції на одних і тих самих тваринах впродовж тривалого часу без порушень функціонування шлунково-кишкового тракту поза проведенням спроб. В між дослідний період сік шлункових залоз надходив до шлунка, що запобігало розладам травлення і шлункового сокоутворення. Для отримання шлункового вмісту у щурів використовувався тонкий металевий зонд, за допомогою якого в шлунок тварин вводили 2 мл дистильованої води і відразу, не виймаючи зонда, ним відбирали вміст шлунка разом із введеною рідиною. Дослідження біохімічного складу шлункового вмісту за цією методикою здійснювали на різних етапах розвитку алкогольного панкреатиту: після чотирьох, восьми і дванадцяти тижнів від початку алкоголізації, а також на 10 та 63 доби перебігу хронічного некротичного панкреатиту викликаного L-аргініном. Дослідження шлункової секреції за цією методикою дозволяло здійснювати кількісну оцінку біохімічного складу шлункового вмісту, проте не дозволяло одержувати для аналізу шлунковий сік в чистому вигляді, точно визначати кількість продукованого шлунковими залозами секрету в досліді, досліджувати якісний склад секрету, а також характеризувати секреторну функцію шлунка в цілому.

Дослідження секреторної функції шлунка у щурів по закінченню всього терміну алкоголізації (14 тижнів), проводили методом перев’язки пілоруса за Х.Шеєм та співавторами [ ]. Досліди проводились на наркотизованих тваринах (тіопентал натрію в дозі 35 мг/кг, розчинений в 1 мл фізіологічного розчину, внутрішньоочеревинно) і полягали в наступному. Пошаровий розтин черевної стінки довжиною 2-2,5 см проводили по білій лінії живота на 0,5 см нижче мечоподібного відростка. У рану підтягували шлунок разом із сальником. Між крупними судинами у ділянці пілоричного сфінктера шлунка накладали лігатуру. Після цієї маніпуляції впродовж 4 годин досліду збирали одну порцію шлункового соку, вимірювали її об’єм (мл), рН, вміст в соку соляної кислоти (мкмоль), концентрацію загального білка (мкг/мл) з подальшим розрахунком його дебіту, а також концентрації груп вільних амінокислот (мг%).

Кількість і хімічний склад одержаного шлункового соку порівнювали з таким контрольних спроб. Різниця в показниках рівня шлункової секреції і якості шлункового соку дозволяла певним чином судити про секреторну функцію шлунка за умов панкреатитів.

Кислотоутворююча функція шлунка характеризується кількістю соляної кислоти в шлунковому соку, у якому вона може знаходитись у вигляді дисоційованих іонів водню і хлору (вільна соляна кислота) або зв’язаною з білками (зв’язана соляна кислота). Існує поняття про загальну кислотність, яке включає в себе суму всіх кислотореагуючих речовин, які знаходяться в шлунку: вільної і зв’язаної соляної кислоти, кислих фосфатів і органічних кислот. Найбільш повне уявлення про кислотоутворюючу функцію обкладових клітин шлунка можна отримати при визначенні показника концентрації вільної соляної кислоти в шлунковому соку .

Концентрацію вільної соляної кислоти в аспіраті (суміш вмісту шлунка з дистильованою водою, яка в нього вводилась) визначали шляхом титрування шлункового вмісту сантинормальним розчином гідроксиду натрію (NaOH) в присутності індикатора диметиламіноазобензолу (0,5% спиртовий розчин). Кислотність шлункового вмісту визначалась кількістю мікролітрів сантинормального лугу, використаного для титрування 0,2–0,5 мл шлункового вмісту з кожної проби, при перерахунку на 100 мл. В подальшому концентрацію соляної кислоти в аспіраті переводили в ммоль/л.

Цільний шлунковий сік, отриманий методом перев’язки пілоруса, центрифугували зі швидкістю 3500 об/хв. впродовж 10-ти хвилин. Надосадову рідину відбирали і вимірювали її рН та вміст загальної соляної кислоти шляхом титрування 0,01 Н розчином гідроксиду натрію до рН 7,0 за допомогою рН метра. Кількість NaOH, використаного на титрування шлункового соку, зібраного за час всього досліду, дорівнювала дебіту загальної соляної кислоти, виділеної залозами шлунка за цей час. Обраховували дебіт НСl, виділеної за 1 год досліду (мкмоль). Дебіт соляної кислоти дозволяє здійснити більш об’єктивну оцінку кислотоутворюючої функції шлунка, оскільки цей показник характеризує кількість соляної кислоти, виділеної обкладовими клітинами за час досліду.

Загальний білок шлункового соку визначали спектрофотометричним методом, який ґрунтується на здатності пептидних зв’язків поглинати ультрафіолетове світло в діапазоні 215-225 нм [ ]. Таким чином, вимірюючи величину оптичної густини при цій довжині хвилі, можна судити про кількість білка, присутнього в розчині.

Для визначення концентрації загального білка в цільному шлунковому соку відбирали 200 мкл секрету і додавали до нього 100 мкл концентрованого (22,5%) аміаку для нейтралізації і осадження соляної кислоти та 1,8 мл охолодженої до 0⁰С суміші ацетону з етанолом у співвідношенні 3:1 для коагуляції білків. Проби охолоджували впродовж 25-30 хв і центрифугували 7 хвилин при 3000 об/хв. Під час центрифугування білок випадав в осад. Депротеїнізовану надосадову рідину (екстракт) зливали у конусовидні пробірки для визначення в ній вмісту гексозаміну та груп вільних амінокислот. До осаду додавали 2,5 мл дистильованої води, ретельно перемішували скляною паличкою і через 1 год досліджували на спектрофотометрі СФ-46 при зазначеній довжині хвилі в кюветі з довжиною оптичного шляху 1 см. В якості контролю використовували дистильовану воду. Розрахунки проводили по калібрувальних кривих, побудованих попередньо за розчинами чистого білка (альбумін сироватки) з відомою концентрацією у перерахунку кількості мкг білка на 1 мл досліджуваного шлункового соку. Дебіт загального білка в шлунковому соку за годину досліду визначали математично, перемножуючи його кількість в одиниці об’єму на величину годинної порції секрету.

Концентрацію загального білка в аспіраті визначали аналогічно. До 600 мкл аспірату додавали 50 мкл концентрованого (22,5%) аміаку та 3 мл ацетон-етанольної суміші, центрифугували, зливали екстракт і додавали до осаду 2,5 мл дистильованої води, перемішували та досліджували на спектрофотометрі. Розраховували кількість мкг білка на 1 мл досліджуваного аспірату.

Надосадову рідину, отриману після осадження білків і центрифугування шлункового соку або аспірату, використовували для визначення концентрацій гексозаміну та груп вільних амінокислот 73,74. Екстракт висушували при температурі 37-40⁰С до сухого залишку, який розчиняли у 50 мкл суміші етанол-вода (1:1). Розподіл груп амінокислот проводили за допомогою хроматографії на папері FN-1 (Filtrac, Німеччина) в системі розчинників ізоаміловий спирт – бутанол - оцтова кислота - мурашина кислота - бензиловий ефір бензойної кислоти – деіонізована дистильована вода (9:4:4:1:2:5). Після фарбування хроматограм нінгідриновим реактивом (0,2%-ий розчин нінгідрину в ацетоні) іх проявляли в закритій від світла камері. Ідентифікацію гексозаміну та груп амінокислот проводили за допомогою стандартів. Кількісну оцінку вмісту гексозаміну та окремих груп амінокислот здійснювали за допомогою денситометра ДО-1М (λ=554 нм) у відповідності до калібрувальних кривих, викреслених з цією метою.

Фактичний матеріал оброблено за допомогою пакету прикладних програм Statistica 6.0 методом варіаційної статистики з урахуванням t-критерію Стьюдента, оскільки дані мали нормальний розподіл при перевірці їх за тестом Шапіро–Уілка. Достовірними вважалися відмінності між контролем і дослідом при р<0,05.

РОЗДІЛ 3

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ