Необратимое ингибирование – образование ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента. В результате фермент не выполняет каталитическую функцию. Ионы тяжелых Ме (ртуть, серебро, мышьяк) – блокируют сульфгидрильные группы активного центра. Субстрат не подвергается химическому превращению. Наличие реактиваторов – ферментативная функция восстанавливается. Ионы тяжелых Ме вызывают денатурацию белковой молекулы фермента, полная инактивация фермента.

• Специфические и неспецифические ингибиторы – блокируют определенные группы активного центра ферментов.

Группы участвуют в катализе, происходит полная инактивация фермента.

Гидроксильные группы серина в механизме катализа используют с помощью фторфосфатов.

Пример: дизопропилфторфосфат (ДФФ) – реагирует с одним остатком серина в активном центре фермента. Остаток Сер способен реагировать с ДФФ, имеет идентичное аминокислотное окружение.

ДФФ – специфический необратимый ингибитор (сериновых) ферментов. Образует ковалентную связь с гидроксильной группой серина.

Пример2: Ацетат йода, п-хлормеркурибензоат вступают в реакции с SH-группами остатков цистеина белков. Неспецифичные ингибиторы, так как реагируют с любыми свободными SH-группами белков. SH-группы принимают участие в катализе, с помощью этих ингибиторов представляется возможным выявление роли SH-групп ферментов в катализе.

• Необратимые ингибиторы ферментов как лекарственные препараты

Пример: аспирин – противовоспалительный нестероидный препарат, ингибирование циклооксигеназы – катализирует реакцию образования простагландинов из арахидоновой кислоты. В результате: ацетильный остаток аспирина присоединяется к свободной концевой NH2-группе одной субъединицей циклооксигеназы. Снижение образование продуктов реакции простагландинов, которые являются медиаторами воспаления.

Регуляция метаболических процессов

Клеточный (стационарный) гомеостаз – клетка стремится сохранить неизменным свой внутренний состав. Клетка реагирует на изменение окружающей среды и на функциональную активность соседних клеток.

Метаболические пути – последовательное превращение одних соединений в другие. Их формируют химические реакции, которые постоянно происходят в клетке.

Метаболизм – совокупность всех метаболических путей, протекающих в клетках организма.

Катаболизм – распад сложных веществ до простых с высвобождением энергии.

Анаболизм – синтез из простых более сложных веществ.

Метаболические пути согласованы между собой по месту, времени и интенсивности протекания.

Эта согласованность протекания всех процессов обеспечивается сложными и многообразными механизмами регуляции.

1. Организация химических реакций в метаболическом пути.

Оптимальная активность ферментов, катализирующих реакции одного метаболического пути, достигается благодаря определенной пространственной организации в клетке.

• Пространственная локализация ферментов – все ферменты находятся в одном отделе клетки. Важно разделение метаболических путей для противоположно направленных катаболических и анаболических процессов.

Пример: синтез жирных кислот происходит в цитоплазме, а их распад в митохондриях. Если без разделения, образовывались бы бесполезные с функциональной и энергетической точки зрения пути.

В метаболических путях: продукт первой ферментативной реакции – субстрат второй, происходит формирование конечного продукта. Метаболические пути связаны между собой промежуточными продуктами.

Мультиферментный комплекс – пространственная организация сильно выражена, продукт реакции ни при каких условиях не может быть вычленен из метаболического пути и служит субстратом следующей реакции. Возникает в результате структурно-функциональной организации ферментов. Такие комплексы связаны с мембранами.

Пример: пируватдегидрогеназный комплекс - происходит окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты (пирувата), синтазу жирных кислот, катализирующую синтез пальмитиновой кислоты.

• Структура метаболических путей

Линейный метаболический путь – субстрат в результате ряда ферментативных процессов превращается в один продукт.

Разветвленный путь – приводит к синтезу различных конечных продуктов в зависимости от потребности клетки.

Циклический путь

Спиральный путь

• Органоспецифичность – ферментный состав различных клеток неодинаков.

Ферменты, выполняющие функцию жизнеобеспечения клетки, находятся во всех клетках организма.

При дифференцировки клеток происходит изменение ферментного состава клеток.

Пример: аргиназа – участвует в синтезе мочевины, находится только в клетках печени.

Пример2: кислая фосфатаза – участвует в гидролизе моноэфиров ортофосфорной кислоты, - в клетках простаты.

Пример3: в клетках сердечной мышцы имеется повышенное количество ферментов креатинкиназы и аспартатаминотрансферазы, в клетках печени – аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, в остеобластах – щелочной фосфатазы.

• Компартментализация

Многообразие функций клетки обеспечивается пространственной и форменной (в зависимости от ритма питания) регуляцией определенных метаболических путей.

Пространственная регуляция связана со строгой локализацией определенных ферментов в различных органеллах.

В ядре находятся ферменты, связанные с синтезом молекул ДНК и РНК.

В цитоплазме – ферменты гликолиза.

В лизосомах – гидролитические ферменты.

В матриксе митохондрий – ферменты ЦТК.

Во внутренней мембране митохондрий – ферменты цепи переноса электронов.

Митохондрия – окислительное декарбоксилирование пирувата, цикл трикарбоновых кислот, окисление жирных кислот.

Цитоплазма – гликолиз, глюконеогенез, синтез белка, синтез жирных кислот, синтез холестерина.

Ядро – синтез ДНК и РНК.

Лизосомы – деградация комплексов макромолекул.

Субклеточная локализация ферментов способствует упорядоченности биохимических процессов и увеличивает скорость обмена веществ.

2. Принципы регуляции метаболических путей

Чтобы воздействовать на скорость протекания метаболического пути, достаточно регулировать количество или активность ферментов. Благодаря ключевым ферментам происходит регуляция скорости всего пути. Это регуляторные ферменты катализируют начальные реакции метаболического пути, необратимые реакции, скорость-лимитирующие реакции (самые медленные) или реакции в месте переключения метаболического пути (точки ветвления).

Регуляция скорости ферментативных реакций осуществляется на 3 независимых уровнях:

• Изменением количества молекул фермента

• Доступностью молекул субстрата и кофермента

• Изменением каталитической активности молекулы фермента

• Регуляция количества молекул фермента в клетке

Белки в клетке постоянно обновляются.

Количество молекул фермента в клетке определяется соотношением 2 процессов – синтеза и распада белковой молекулы фермента.

Синтез и фолдинг белка – многостадийный процесс. Регуляция синтеза белка происходит на стадии формирования белковой молекулы. Транскрипция – осуществляется определенными метаболитами, гормонами и рядом биологически активных молекул.

Распад ферментов – сложный механизм, процесс протеолиза (разрушения белковой молекулы), определяется на генетическом уровне.

• Регуляция скорости ферментативной реакции доступностью молекул субстрата и коферментов.

Наличие субстратов (первого!)

Чем больше концентрация исходного субстрата, тем выше скорость метаболического пути.

Наличие регенерированных коферментов лимитирует протекание метаболического пути.

Пример: реакция дегидрирования. Кофермент дегидрогеназ – окисленныеформы NAD+, FAD, FMN – восстанавливаются в ходе реакции.

Необходима регенерация (превращение в окисленную форму) коферментов, чтобы участвовали вновь в реакции.

• Регуляция каталитической активности ферментов – высокоэффективный и быстрый способ регуляции метаболизма.

Значение в изменении скорости метаболических путей.

Основные способы регуляции активности ферментов:

- аллостерическая регуляция

- регуляция с помощью белок-белковых взаимодействий

- регуляция путем фосфорилирования/дефосфорилирования молекулы фермента

- регуляция частичным протеолизом

• Аллостерическая регуляция

Аллостерические ферменты – ферменты, активность которых регулируется количеством молекул субстрата и эффекторами.

Эффекторы – клеточные метаболиты именно того пути, регуляцию которого они осуществляют.

• Роль аллостерических ферментов в метаболизме клетки

Быстро реагируют на малейшие изменения внутреннего состояния клетки.

Значение в следующих ситуациях:

- при анаболических процессах. Регуляция синтеза – ингибирование конечным продуктом метаболического пути и активация начальными метаболитами

- при катаболических процессах. Накопление АТФ в клетке, ингибирование метаболических путей, обеспечивающих синтез энергии. Субстраты расходуются на реакции запасания резервных питательных веществ

- для координации анаболических и катаболических путей. АТФ и АДФ - аллостерические эффекторы как антагонисты

- для координации параллельно протекающих и взаимосвязанных метаболических путей (синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, используемых для синтеза нуклеиновых кислот)

• Аллостерические эффекторы

Ингибитор – эффектор, вызывающий снижение активности фермента.

Активатор – эффектор, вызывающий повышение активности фермента.

Различные метаболиты.

Ингибитор – конечный продукт метаболического пути.

Активатор – исходное вещество метаболического пути.

Гетеротропная регуляция.

Редко гомотропная регуляция: когда сам субстрат может выступать в качестве положительного эффектора. Эффектор и субстрат одно и то же вещество. Эти ферменты имеют несколько центров связывания для субстрата, выполняют каталитическую и регуляторную функции.

Ферменты используются когда субстрат накапливается в избытке и должен быстро преобразовываться в продукт.

Ферменты не подчиняются законам Михаэлиса-Ментен, имеют характреную S-образную кривую зависимости скорости реакции от концентрации субстрата.

• Особенности строения и функционирования аллостерических ферментов

1. это олигомерные белки. Состоят из протомеров, имеют доменное строение

2. имеют аллостерический центр, пространственно удаленных от каталитического активного центра

3. эффекторы присоединяются к ферменту нековалентно в аллестерических (регуляторных) центрах

• Локализация аллостерических ферментов в метаболическом пути

• Регуляция каталитической активности ферментов белок-белковыми взаимодействиями

• Активация ферментов в результате присоединения регуляторных белков

• Регуляция каталитической активности ферментов ассоциацией/диссоциацией протомеров

• Протеинкиназа А

• Регуляция каталитической активности ферментов путем фосфорилирования/ дефосфорилирования

• Регуляция каталитической активности ферментов частичным (ограниченным) протеолизом

Энзимопатии

1. Нарушение образования конечных продуктов

2. Клинические проявления

3. Накопление субстратов-предшественников

4. Клинические проявления

5. Нарушение образования конечных продуктов и накопление субстратов предшественников

6. Клинические проявления

Применение ферментов в медицине

1. Энзимодиагностика

   • Причины, прифодящие к увеличению количества ферментов в крови

   • Изоферменты

   • Изоформы лактатдегидрогеназы

   • Лактатдегидрогеназа

   • Изоформы креатинкиназы

   • Энзимодиагностика при инфаркте миокарда

2. Применение ферментов в качестве лекарственных средств