Мультисубстратные реакции

Участники ферментативной реакции: фермент, несколько субстратов и кофермент.

• Механизм «пинг-понг» (механизм двойного действия)

Субстрат, взаимодействуя с ферментом, превращается в продукт. Фермент остается в результате преобразования не в нативной форме, а в измененной в результате модификации кофермента. Далее к активному центру присоединяется субстрат, подвергающийся преобразованию в продукт с высвобождением нативной формы фермента.

Пример: реакции трансаминирования с участием аминотрансфераз (кофермент пиридоксальфосфат) – катализирует обратимые реакции переноса аминогруппы с аминокислоты на кетокислоту.

Пример2: реакции дегидрирования с участием кофермента FAD (флавинадениндинуклеотид)(Пример: сукцинатдегидрогеназная реакция. Второй субстрат – убихинон – один из посредников ЦПЭ.) или FMN (флавинмононуклеотид), которые прочно связаны с ферментом и не рассматриваются в качестве второго субстрата.

• Последовательный механизм – для протекания ферментной реакции требуется одновременно взаимодействие двух субстратов.

• Механизм упорядоченного взаимодействия субстрата с активным центром фермента

Первым в активный центр фермента присоединяется первый субстрат, облегчая присоединение второго субстрата. После химической модификации наблюдают определенный порядок высвобождения продуктов реакции.

Пример: реакция дегидрирования с участием коферментов NAD+, NADP+. Ферменты функционируют как посредники переноса двух электронов и одного протона от донора к акцептору, другого протона – в среду. Донор и акцептор не обязательно участвуют в одном метаболическом пути. Восстановленная форма нуклеотидов – общий пул электронов, образованный в результате окислительных реакций, может быть использована в различных восстановительных реакциях. Такие реакции – сопряженные.

Две ферментативные реакции, катализируемые ферментами, сопряжены друг с другом посредством кофермента NAD+ (субстрат). Для первого фермента субстрат – окисленная форма NAD, второй субстрат – донор водорода, продукт – восстановленная форма NAD, для второго фермента – наоборот.

• Механизм случайного взаимодействия субстрата с активным центром фермента

Каждый субстрат имеет свой центр связывания в активном центре (нет приоритетности за взаимодействие субстратов в активном центре фермента). Нет строгой закономерности высвобождения продуктов реакции.

Механизм действия ферментов

1. Энергетические изменения при химических реакциях

Законы термодинамики: сохранения энергии и энтропии.

Энергия химической системы и окружения постоянна.

Химическая система стремится к снижению упорядоченности (увеличению энтропии).

Реакция разложения угольной кислоты.

Энергия активации – дополнительное количество кинетической энергии, необходимое молекулам вещества, чтобы они вступили в реакцию.

Достижение энергетического барьера, в молекуле изменения, перераспределение химических связей, образование новых соединений.

Свободная энергия реакции – разница энергии между исходным реагентом и конечными соединениями.

Выделившаяся энергия рассеивается в виде тепла в окружающую среду.

Чем больше молекул обладает энергией, превышающей уровень энергии активации, тем выше скорость химической реакции.

Повысить скорость химической реакции можно нагреванием (губительно в клетке). ФЕРМЕНТЫ – для ускорения химических реакций путем понижения энергии активации.

Ферменты снижают высоту энергетического барьера, возрастает количество реакционно-способных молекул, увеличивается скорость реакции.

Фермент-субстратный комплекс!

Ферменты не изменяют свободную энергию субстратов и продуктов, не меняют равновесие реакции.

Сходство ферментов с небиологическими катализаторами:

• Ферменты катализируют энергетически возможные реакции

• Энергия химической системы остается постоянной

• В ходе катализа направление реакции не изменяется

• Ферменты не расходуются в процессе реакции

Отличие ферментов от небиологических катализаторов:

• Скорость ферментативных реакций выше, чем реакций, катализируемых небелковыми соединениями

• Ферменты обладают высокой специфичностью

• Ферментативная реакция проходит в клетке при температуре 37, постоянном атмосферном давлении и физиологическом значении рН (рН крови соответствует 7,36)

• Скорость ферментативной реакции может регулироваться

2. Этапы ферментативного катализа

   • Формирование фермент-субстратного комплекса. Гипотеза «индуцированного соответствия».

Активный центр – гибкая структура по отношению к субстрату. Субстрат взаимодействует с активным центром фермента, вызывает изменение конформации, формирование комплекса. Комплекс благоприятен для химических модификаций субстрата. Молекула субстрата изменяет свою конформацию, высокая эффективность реакции.

• Последовательность событий в ходе ферментативного катализа

1,2 и 4 этапы катализа непродолжительны, зависят от концентрации субстрата (для 1 этапа) и констант связывания лигандов в активном центре фермента (для 1 и 3 этапа). 3 этап медленный, длительность зависит от энергии активации химической реакции. Происходит на 3 этапе разрыв связей в молекуле субстрата, образование новых связей, формирование молекулы субстрата. Молекула фермента во много раз больше молекулы субстрата, подвергающегося химическому превращению этим ферментом.

• Роль активного центра в ферментативном катализе

В контакт с субстратом вступает 5/10 аминокислотных остатков, формирующих активный центр фермента. Роль остальных остатков – обеспечение правильной конформации молекулы фермента для оптимального протекания химической реакции.

Свойства активного центра:

- использует химические механизмы, способствующие превращению субстрата в продукт

- эффект сближения и ориентации реагентов (функциональные группы субстратов находятся близко друг к другу). Упорядоченное расположение субстратов, уменьшение энтропии, снижение энергии активации, что определяет каталитическую эффективность ферментов

- эффект деформации субстрата - способствует дестабилизации межатомных связей в молекуле субстрата, облегчает протекание химической реакции и образование продуктов

Этапы катализа:

1. этап сближения и ориентации субстрата относительно активного центра фермента

2. образование фермент-субстратного комплекса в результате индуцированного соответствия

3. деформация субстрата и образование нестабильного комплекса фермент-продукт

4. распад комплекса фермент-продукт с высвобождением продуктов реакции из активного центра фермента и высвобождением фермента

3. Молекулярные механизмы ферментативного катализа

   • Кислотно-основный катализ

Аминокислотные остатки в составе активного центра имеют функциональные группы, которые проявляют свойства кислот и оснований.

Аминокислоты: Цис, Тир, Сер, Лиз, Глу, Асп, Гис.

Радикалы аминокислот в протонизированной форме – кислоты (доноры протона), в депротонизированной – основания (акцепторы протона).

Пример: кофакторы – ионы цинка, кофермент – молекула NAD+. Алкогольдегидрогеназа печени катализирует реакцию окисления спирта.

Механизм кислотно-основного катализа на примере алкогольдегидрогеназы печени:

1. молекула этилового спирта имеет центр связывания, обеспечивающий гидрофобное взаимодействие активного центра и метильной группы спирта

2. положительно заряженный атом цинка способствует отщеплению протона от спиртовой группы этанола с образованием отрицательно заряженного атома кислорода. Отрицательный заряд перераспределяется между атомом кислорода и соседним атомом водорода, который затем в виде гидрит-иона переносится на четвертый углеродный атом никотинамида кофермента NAD+

3. в результате формируется восстановленная форма NADН и уксусный альдегид

• Ковалентный катализ

Атака нуклеофильных (- заряженных) или электрофильных (+ заряженных) групп активного центра фермента молекулами субстрата с формированием ковалентной связи между субстратом и коферментом или функциональной группой аминокислотного остатка

(одной) активного центра фермента.

Пример: действие сериновых протеаз – трипсин, химотрипсин, тромбин – ковалентная связь образуется между субстратом и аминокислотным остатком серина активного центра фермента.

«Сериновые протеазы» - аминокислотный остаток серины входит в состав активного цента всех ферментов и участвует в катализе.

Пример2: химотрипсин – осуществляет гидролиз пептидных связей при переваривании белков в двенадцатиперстной кишке. Субстраты – пептиды, содержащие аминокислоты с ароматическими и циклическими гидрофобными радикалами (Фен, Тир, Три).

Радикалы Асп102, Гис57 и Сер 195 участвуют в акте катализа.

Нуклеофильная атака пептидной связи субстрата, разрыв связи с образованием ковалентно-модифицированного серина – ацилхимотрипсина. Другой пептидный фрагмент высвобождается в результате разрыва водородной связи между пептидным фрагментом и Гис57 активного центра химотрипсина.

Заключительный этап гидролиза пептидной связи белков – деацилирование химотрипсина в присутствии молекулы воды с высвобождением второго фрагмента гидролизуемого белка и исходной формы фермента.

Кинетика ферментативных реакций – раздел энзимологии, изучающий зависимость скорости химических реакций, катализируемых ферментами, от химической природы реагирующих веществ, а также от факторов окружающей среды.

Зависимость накопления продукта и убыли субстрата от времени (продолжительности) протекания реакции.

• Скорость ферментативной реакции определяется изменением концентрации продукта или субстрата за единицу времени. В реакциях, катализируемых двумя фрагментами, начальные скорости реакции, катализируемые ферментами, различны.

1. Зависимость скорости ферментативной реакции от количества ферментов

Скорость реакции зависит от концентрации фермента (в условиях избытка субстрата).

Графическая зависимость реакции – прямая линия (диагональ).

Количество фермента не определяется в абсолютных величинах.

Пользуются условными величинами, характеризующими активность фермента: 1 международная единица активности (МЕ) – катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при оптимальных условиях (зависят от температуры среды, рН раствора, при отсутствии активаторов и ингибиторов) проведения ферментативной реакции.

1 МЕ =1 мкмоль/1 мин

1 катал = 1 моль субстрата/1 с

Для оценки количества молекул фермента среди других белков данной ткани определяют удельную активность фермента, численно равную количеству единиц активности фермента в образце ткани, деленному на массу белка в этой ткани.

По удельной активности судят об очистке фермента: чем меньше посторонних белков, тем выше удельная активность.

2. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры среды

Повышение температуры, ускоряется движение молекул, повышение вероятности взаимодействия реагирующих веществ.

Повышение энергии реагирующих молекул, ускорение реакции.

Скорость химической реакции, катализируемая ферментами, имеет свой температурный оптимум, превышение которого сопровождается понижением ферментативной активности (возникает из-за термической денатурации белковой молекулы).

Пример: для ферментов оптимальна температура 37-38.

Пример2: термостабильный фермент – Taq-полимераза (выделена из микроорганизмов, живущих в горячих источниках) не инактивируется при повышение температуры до 95.

Используют для молекулярной диагностики заболеваний с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

3. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды

Отклонение от оптимального значения рН, понижение ферментативной активности.

Влияние рН на активность ферментов – ионизация функциональных групп аминокислотных остатков данного белка.

Пример: закисление среды – протонирование свободных аминогрупп, при защелачивании – отщепление протона от карбоксильных групп. Изменение конформации молекулы фермента и конформации активного центра. Нарушается присоединение субстрата, кофакторов и коферментов к активному центру. рН среды влияет на степень ионизации или пространственную организацию субстрата.

Отклонение от значения рН, денатурация белковой молекулы, полная потеря ферментативной активности.

Пример: пепсин в желудке или лизосомальные ферменты – приобретают конформацию, обеспечивающую работу ферментов при кислых значениях рН.

4. Зависимость скорости ферментативной реакции от количества субстрата

Концентрация ферментов постоянна, изменяем количество субстрата, график – гипербола.

Увеличение количества субстрата, начальная скорость возрастает.

Фермент стал насыщенным субстратом, наибольшая скорость образования продукта.

Повышение концентрации субстрата не приводит к увеличению образования продукта (скорость реакции не возрастает).

Концентрация фермента – лимитирующий фактор в образовании продукта.

Скорость реакции пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса.

Скорость образования зависит от концентраций субстрата и свободного фермента.

На концентрацию влияет скорость формирования и распада комплекса.

Наибольшая скорость реакции – все молекулы фермента в комплексе с субстратом.

V=Vmax субстрата/соотношение констант скоростей - Уравнение Михаэлиса-Ментен

Vmax – каталитическая активность фермента (моль/л) определяет максимальную возможность образования продукта при данной концентрации фермента и в условиях избытка субстрата.

Km – сродство фермента к субстрату – постоянная величина, не зависит от концентрации фермента.

Чем меньше Km, тем больше сродство фермента к субстрату, выше начальная скорость реакции.

Ингибирование ферментативной активности

1. Обратимое ингибирование. Обратимые ингибиторы связываются с ферментом слабыми нековалентными связями, при определенных условиях легко отделяются от фермента.

   • Конкурентное – обратимое снижение скорости ферментативной реакции, вызвано ингибитором, который имеет связь с активным центром фермента, препятствует образованию комплекса.

Ингибитор – структурный аналог субстрата.

В результате - конкуренция молекул субстрата и ингибитора за место в активном центре фермента.

Пример: ингибирование сукцинатдегидрогеназной реакции малоновой кислотой (структурным аналогом сукцината). Отщепление 2х атомов водорода от малоновой кислоты невозможно, скорость реакции снижается. 1 – сукцинат связывается с активным центром фермента сукцинатдегидрогеназы. 2 – в ходе ферментативной реакции происходит отщепление двух атомов водорода от сукцината и присоединение их к коферменту FAD. В результате образуется фумарат, который высвобождается из активного центра сукцинатдегидрогеназы. 3 – малоновая кислота связывается с активным центром сукцинатдегидрогеназы. Химическая реакция не идет.

• Кинетические зависимости

Конкурентные ингибиторы уменьшают скорость химической реакции, повышают Km для субстрата.

Увеличение соотношения концентрации субстрата и ингибитора снижает степень ингибирования.

• Лекарственные препараты как конкурентные ингибиторы

Пример: четвертичные аммониевые основания ингибируют ацетилхолинэстеразу – катализирует реакцию гидролиза ацетилхолина на холин и уксусную кислоту. Добавление ингибиторов, активность фермента уменьшается. Концентрация субстрата увеличивается, усиление проведения нервного импульса.

Ингибиторы используют при лечении мышечной дистрофии.

Прозерин, эндрофоний.

• Антиметаболиты (ингибиторы ферментов) как лекарственные препараты

Эти соединения – структурные аналоги природных субстратов, вызывают конкурентное ингибирование, могут использоваться этими же ферментами как псевдосубстраты (синтез аномальных продуктов – не обладают функциональной активностью, снижение скорости метаболических путей).

Сульфаниламидные препараты (аналоги парааминобензойной кислоты) – для лечения инфекционных заболеваний.

Аналоги нуклеотидов – для лечения онкологических заболеваний.

• Неконкурентное – ингибитор взаимодействует с ферментов в участке, отличном от активного цетра. Не являются структурными аналогами субстрата.

Связывается либо с ферментом, либо с комплексом.

Образуется неактивный комплекс.

Присоединение неконкурентного ингибитора, изменение конформации молекулы фермента, нарушается взаимодействие субстрата с активным центром фермента, снижение скорости реакции.

• Кинетические зависимости – снижение Vmax ферментативной реакции, уменьшение сродства субстрата к ферменту, увеличении Km.