Определение чувствительности бактерий к антибиотикам

Критерием чувствительности микроорганизмов к антибиотикам является минимальная концентрация антибиотика, ингибирующая (задерживающая) рост возбудителя при стандартных условиях постановки опыта. При определении лекарственной устойчивости используют чистую культуру возбудителя, выделенную до начала лечения антибиотиками. Изучение чувствительности проводят методом диффузии в агар с применением стандартных дисков или методом серийных разведении в жидких и плотных средах.

Определение чувствительности к антибиотикам методом бумажных дисков основано на диффузии антибиотика в питательную среду Концентрация антибиотиков в дисках подобрана таким образом, чтобы диаметры зон задержки роста стандартных тест-микроорганизмов соответствовали международным стандартам. В 2004 году Госсанэпиднадзором России утверждена новая инструкция определения чувствительности к антибиотикам, учитывающая общепринятые международные стандарты в этой области. Согласно этим рекомендациям для исследования берут 3-5 колоний выделенной чистой культуры, из которых затем готовится клеточная взвесь на физиологическом растворе или бульоне (Мюллер-Хинтона). С помощью оптического стандарта мутности на 0,5 ед. (по МсФарланду), что соответствует 1,5 х 10⁸ КОЕ/мл) клеточная взвесь стандартизируется. Затем стерильным ватным тампоном, смоченным в приготовленной взвеси, исследуемые бактерии засевают в чашке Петри со специальной средой (чаще всего агар Мюллер-Хинтона). Заштриховав всю поверхность агара вначале один раз, её заштриховывают еще дважды, предварительно вращая чашку каждый раз на 60⁰. Стерильным пинцетом на засеянную поверхность помещают на равном расстоянии друг от друга, от краев и центра чашки стандартные бумажные диски, пропитанные растворами различных антибиотиков. Засеянные чашки выдерживают в термостате при температуре, оптимальной для роста исследуемых бактерий. Если бактерии чувствительны к данному антибиотику, то вокруг дисков образуется зона задержки роста. Диаметр зоны задержки роста соответствует степени чувствительности исследуемого микроорганизма к данному антибиотику. Окончательный результат оценивается по специальным таблицам.

Метод дисков не дает надежных данных при определении чувствительности микроорганизмов к плохо диффундируемым в агар полипептидным антибиотикам (например, полимиксин, ристомицин). Если эти антибиотики предполагается использовать для лечения, рекомендуется определять чувствительность методом серийных разведений. Жидкую среду (пригодную для роста данного микроба) разливают по 2 мл в 10 пробирок. Готовят раствор антибиотика, содержащий 100 ед. в 1 мл, и добавляют 2 мл раствора в 1-ую пробирку. После тщательного перемешивания 2 мл переносят в следующую пробирку и т.д. Из 9-ой пробирки 2 мл удаляют. Десятая пробирка не содержит антибиотика и служит контролем. Суточную культуру микроба разводят с использованием стандарта мутности до густоты 10000 микробов в 1 мл. После чего в каждую пробирку вносят по 0,2 мл взвеси. После 20 ч инкубации в термостате учитывают результат. Среда в пробирках, в которых антибиотик находится в концентрациях, достаточных для подавления роста микроорганизмов, остается прозрачной. Наименьшая концентрация антибиотика, при которой размножение микроорганизмов уже не происходит, а содержимое пробирок остается прозрачным, соответствует наименьшей ингибирующей концентрации данного антибиотика в отношении изучаемого микроорганизма и рассматривается как бактериостатическая, что означает задержку роста бактерий, но не наличие их гибели. Для определения бактерицидной концентрации исследуемого антибиотика в отношении изучаемого микроорганизма (т.е. концентрации препарата, в которой он вызывает гибель клеток) проводят посев бактериологической петлей из пробирок (содержимое которых не помутнело) на полноценную питательную агаризованную среду. Отсутствие роста свидетельствует, что в данной пробирке микроорганизмы полностью убиты данным антибиотиком.

Метод Е-тестов (от англ. ellipse- эллипс, т.к. при наличии чувствительности образуется зона задержки роста эллиптической формы) - сочетает в себе достоинства метода серийных разведении и метода дисков. Вместо дисков используются полоски фильтровальной бумаги, пропитанной различными концентрациями антибиотика. Полоски помещают на поверхность питательного агара, засеянного исследуемой культурой. Если бактерии чувствительны к действию данного препарата, вокруг участков полоски, содержащих его ингибирующие концентрации, возникает эллипсовидная зона.

Метод серийных разведении антибиотика в агаризованной среде удобен тем, что позволяет в одном опыте проверить чувствительность к данному антибиотику нескольких микроорганизмов. Разведения антибиотика готовят в стерильной агаризованной среде. Для этого в нее добавляют требуемое количество исходного раствора антибиотика, тщательно перемешивают и заливают в стерильные чашки Петри. После застывания агара дно чашки с наружной стороны делят маркером на сектора. Каждую исследуемую культуру засевают штрихом с помощью бактериологической петли на отдельный сектор в чашки с разными концентрациями антибиотика. Чашки помещают в термостат при температуре, оптимальной для роста и развития изучаемых бактерий, и инкубируют в течение 40 - 72 часов. Результаты учитывают по наличию или отсутствию роста бактерий в сравнении с ростом на среде в контрольной чашке. Бактерии считаются чувствительными к антибиотику в такой его концентрации, при которой их рост полностью подавляется.

ДЕМОНСТРАЦИИ

1. Демонстрация ферментативной активности бактерий с использованием СИБ для межродовой дифференциации бактерий.

2. Ферментативная активность представителей семейства кишечных бактерий на средах Гисса (Е.coli).

3. Обнаружение выделения сероводорода и индола.

4. Действие летучих и нелетучих фракций фитонцидов чеснока у бактерии.

5. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам методами: а) диффузии в агаре с помощью бумажных дисков и градуированных полосок (Е-тест); б) серийных разведений.

6. Определение концентрации антибиотика в сыворотке крови.

7. Флаконы и ампулы с различными антибиотиками и дисками для определения антибиотикочувствительности.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1. Каждый студент учитывает рост культуры на скошенном агаре, приготавливает мазок, окрашивает по Граму.

2. Бригада студентов производит пересев культуры со скошенного агара на «пестрый ряд» (изучение биохимических свойств).

3. Бригада студентов определяет чувствительность выделенной культуры к антибиотикам методом бумажных дисков.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Какую роль выполняют ферменты у бактерий?

2. Какова классификация ферментов у бактерий?

3. Каков принцип идентификации бактерий по биохимическим свойствам?

4. Как изучаются сахаролитические свойства бактерий и какие питательные среды для этого применяются?

5. Как и на каких питательных средах изучаются протеолитические свойства бактерий?

6. Что такое «пестрый ряд»?

7. Что собой представляет СИБ и в чем ее назначение?

8. Какие газообразные продукты образуются при расщеплении бактериями белков и как их определяют?

9. Назовите ферменты биологического окисления и как их выявляют?

10. Назовите формы симбиотических взаимоотношений между микроорганизмами.

11. Каковы формы конкурентных взаимоотношений между микроорганизмами?

12. Что такое микробный антагонизм и каковы практические аспекты его применения?

13. Что такое химиотерапия, каковы ее принципы?

14. Какие существуют химиотерапевтические препараты?

15. Что такое химиотерапевтический индекс?

16. Что такое антибиотики?

17. Какова классификация антибиотиков по способам получения, по химическому строению, происхождению, механизму и спектру антимикробного действия?

18. Каков механизм действия противоопухолевых антибиотиков?

19. Какие вы знаете осложнения антибиотикотерапии?

20. Как предупредить развитие дисбактериоза при антибиотикотерапии?

21. Как предупредить или снизить выраженность побочного действия антибиотиков на организм больного?

22. Каковы механизмы формирования антибиотикорезистентных культур?

23. Что способствует формированию антибиотикорезистентности у бактерий?

24. Какие мероприятия могут способствовать предупреждению формирования антибиотикорезистенности у бактерий?

25. Какие существуют методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам?

26. В чем заключается проблема получения и применения противовирусных химиопрепаратов?

27. Что такое аномальные нуклеозиды и каков механизм их действия при лечении вирусных инфекций?

28. Каков механизм действия азидотимидина и других веществ, ему подобных, применяемых для лечения СПИДа?

ЗАНЯТИЕ №8

Темы:

• Методы выделения и идентификации чистых культур аэробных бактерий, определение чувствительности к антибиотикам (окончание).

• Медицинская экология микроорганизмов. Санитарно - бактериологическая оценка объектов окружающей среды, пищевых продуктов.

План занятий:

1. Идентификация выделенной чистой культуры по биохимическим свойствам, учет чувствительности к антибиотикам.

2. Природные микробиоценозы. Экологические среды микробов.

3. Санитарно-показательные бактерии, их характеристика.

4. Определение микробного числа воздуха по методу Коха и с помощью аппарата Кротова.

5. Методы санитарно-бактериологической оценки воды: определение коли-титра, коли-индекса бродильным методом и с помощью мембранных фильтров. Определение микробного числа и коли-фагов.

6. Определение микробной обсемененности кожи рук и предметов обихода методом смывов.

ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Микроорганизмы распространены повсюду. Большинство их в естественных условиях находятся в определенных взаимоотношениях друге другом. В окружающую среду патогенные бактерии попадают от больных, бактерионосителей и находятся там в течение определенного времени. В связи с этим санитарно-бактериологические исследования направлены на изучение и оценку различных объектов в целях определения их эпидемиологической безопасности. Методы проведения санитарно-микробиологических исследований предусматривают определение общей микробной обсемененности (ОМЧ), определение и титрование санитарно-показательных микроорганизмов, выявление в исследуемых объектах патогенных микробов и их метаболитов.

Непосредственное обнаружение патогенных микроорганизмов, как правило, затруднено из-за их малого количества, в связи с чем используются косвенные методы выявления микробной обсемененности постоянно сопутствующих патогенным бактериям санитарно-показательных микробов. ОМЧ расценивается как показатель интенсивности загрязнения окружающей среды органическими веществами.

Санитарно-показательными называют микроорганизмы, по которым можно косвенно судить о возможном присутствии патогенов в окружающей среде. Облигатные микробы кишечника и дыхательных путей являются санитарно-показательными; обнаружение на объектах окружающей среды E.coli. E.faecalis свидетельствует об их фекальном загрязнении. Выделение S.aureus из воздуха свидетельствует о его дыхательно-капельном загрязнении. Содержание санитарно-показательных бактерий оценивается по титру и индексу.

Цель занятия:

1. Изучить методы и показатели, необходимые для санитарно-бактериологической оценки объектов окружающей среды.

Учебно-целевые задачи:

Знать:

1. Природные микробиоценозы. Экологические связи в микробиоценозах.

2. Экологические среды микробов: микрофлора почвы, воды, воздуха, пищевых продуктов, бытовых и производственных объектов и ее роль в распространении инфекционных болезней.

3. Принципы санитарно-микробиологических исследований. Индикация патогенных микробов в объектах окружающей среды, косвенные методы: определение ОМЧ и санитарно-показательных микроорганизмов: бактерий группы кишечной палочки (БГКП), клостридий, стрептококков, стафилококков.

Уметь:

1. Проводить оценку санитарно-бактериологического состояния воздуха, воды, почвы, пищевых продуктов и смывов по микробиологическим тестам.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Санитарно-бактериологическая оценка объектов окружающей среды (ООС).

Санитарно-микробиологическое состояние почвы оценивается на основании сопоставления количества термофильных бактерий и бактерий – показателей фекального загрязнения. Почвы с преобладанием санитарно-показательных бактерий расцениваются как санитарно-неблагополучные, загрязненные фекалиями человека и животных. Присутствие в почве E.coli и E.faecalis указывает на свежее, а Clostridium perfringens – на давнее фекальное загрязнение. Более точная оценка проводится с помощью определения коли-индекса – количество БГКП, или т.н.колиформных бактерий,обнаруженных в 1 г почвы; перфрингенс-титра – масса почвы ( в граммах), в которой обнаружена 1 микробная клетка Clostridium perfringens; общей численности сапрофитных, термофильных и нитрифицирующих бактерий в 1 г почвы.

Санитарно-микробиологическое состояние воды оценивается по: 1). микробному числу – количеству мезофильных хемоорганотрофных бактерий в 1 мл воды; 2). коли-титру – наименьшему объему воды (мл), в котором обнаруживаются БГКП; 3). коли-индексу - количеству БГКП в 1 л воды; 4). Наличию спор сульфитредуцирующих бактерий и цист лямблий.

Санитарно-микробиологическое состояние воздуха закрытых помещений оценивают по: 1).микробному числу – количесву колонеобразующих единиц (КОЕ), обнаруживаемых в 1 м³ воздуха; 2).наличию санитарно-показательных бактерий – представителей микрофлоры дыхательных путей (золотистый стафилококк, гемолитический стрептококк).

Санитарно-микробиологическая оценка пищевых продуктов включает определение 1). микробного числа и 2).санитарно-показательных микроорганизмов (БГКП); 3).патогенных возбудителей.

Микрофлора воздуха. Нормативы.

Чистый воздух зимой: ОМЧ не более 4500, гемолитических стрептококков – до 35;

Грязный воздух зимой: ОМЧ более 7000, гемолитических стрептококков – более 70.

Нормативные показатели микробной обсемененности воздуха в помещениях больницы

Операционные	ОМЧ	Золотистый стафилококк (в 250 л)
до начала работы	не более 500	не допускается
во время работы	не более 1000	не допускается
родильные комнаты	не более 1000	не допускается
палаты для недоношенных детей	не более 750	не допускается

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха проводится седиментационным и аспирационным методами. Седиментационный метод по Коху заключается в том, что чашки Петри со средой оставляют открытыми на 5-10 минут на общую обсемененность и не менее 40 минут на обсемененность патогенной кокковой микрофлорой. Засеянные чашки инкубируют 24 часа в термостате и столько же при комнатной температуре. Количество выросших колоний соответствует степени загрязненности воздуха. На площадь 100 кв.см в течение 5 минет оседает столько бактерий, сколько их содержится в 10 л воздуха.

Аспирационный метод - более точный количественный метод определения микробного числа воздуха. Посев воздуха осуществляется с помощью аппарата Кротова или других современных аспираторов. Аспиратор устроен таким образом, что воздух с заданной скоростью просасывается через узкую щель пластины, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися на них микроорганизмами равномерно фиксируются на всей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входной щелью.