§ 2.9 Результаты экспериментов и их обсуждение

Перед началом регистрации фокусировали камеру на освещённой зелёным светом поверхности кости черепа (или поверхности коры мозга) – это точка отсчета, соответствующая 0 мкм, на рис.5 видно расположение сосудов непосредственно под костью и на некоторой глубине. Использование именно зелёного освещения позволяет чётко выделить кровеносные сосуды всех размеров, сделать снимок их расположения (создать сосудистую карту, зелёный образ) и сфокусироваться на глубину расположения нейронов, участвующих в обработке поступающей с периферии зрительной информации.

Рис. 5. «Зелёный образ». Рис. 6. Глубина 1000мкм

На следующем шаге опускали фокус камеры с шагом в 200 мкм до глубины примерно 800-1000 мкм от поверхности коры (плоскости расположения сосудов) и таким образом уменьшали вклад в итоговое изображение коры артефактов, связанных с кровообращением и сердцебиением (Рис. 6). При регистрации сигнала использовали красный свет. На полученных амплитудных функциональных картах виден участок, содержащий популяционный ответ на стимул (тёмное и светлое – в противофазе – пятно) (Рис. 7, правая половина)

Рис.7. Амплитудная карта Рис. 8. Фазовая карта

На фазовой карте (Рис. 7), однако, сигнал может быть неразличим, так как карта является сильно зашумлённой, а интенсивность ответа очень мала по сравнению с шумом. В такой ситуации карты обрабатывали частотными фильтрами.

Рис.9 Функциональная карта после частотной фильтрации фильтрами

Рис.10 Сосудистая карта с областью активации.

В итоге функциональная фазовая карта приобретает следующий вид (Рис. 9) с хорошо различимой областью, содержащей постепенное изменение цвета, каждая градация которого соответствует определённому положению линии на мониторе – это область нашего интереса, которую выделяли и анализировали далее. При нанесении этой области на сосудистую карту (Рис. 10), дополнительно удостоверялись в отсутствии артефактов, которые могли быть внесены проходящими в данном месте крупными сосудами.

Этап накопления данных для кошек и крыс практически не отличался. В связи с этим описание накопления карт проведено на примере крыс.

Сравнение индивидуальных функциональных карт (Рис. 11) позволяет выявить сходства и различия в топографии сигнала. Сходство выражается в наличие и принципиальной структуре ответа при идентичной стимуляции и может быть описано количественно (размер области, ширина полос и пр.).

1мм

1мм

1мм

1мм

Рис. 11. Сравнение индивидуальных карт, полученных оптическим картированием.

Разница, прежде всего, обусловлена различиями в индивидуальном зрительном опыте животных, а, следовательно, и в строении индивидуального мозга, особенно его коры – созревание и установление связей между зрительными нейронами происходит за короткий промежуток времени у уже зрячего животного. Отчасти это уже не позволяет нам добиться полной идентичности условий регистрации сигнала на разных особях, как-то: сфокусироваться не просто на одинаковой глубине от поверхности коры, но в одинаковых слоях клеток мозга. Словом, морфологические и анатомические особенности строения коры мозга разных животных обуславливают разницу в представлении функциональных ответов их клеток (что дополняется случайными и систематическими ошибками измерения, вносимыми, например, экспериментаторами или приборами).

В тоже время, для одного животного можно констатировать стабильность расположения и структуры метаболической нейронной активности (Рис. 12). При регистрации в разные промежутки времени сигнал обнаруживается в одном и том же месте, периодичность изменения цвета совпадает. Данное сходство можно оценить количественно – используя коэффициент корреляции (r). При предъявлении одного и того же стимула через 15 минут структура ответа совпадает на 88%, через 45 минут или час совпадение может составлять до 90%. Таким образом, обнаруживается высокая степень сходства между картами, полученными для идентичных условий стимуляции, но в разные моменты времени в ходе эксперимента. Было установлено, что коэффициент корреляции может служить действенным инструментом для определения стабильности регистраций оптического сигнала.

Следует отметить, что часто можно наблюдать колебания коэффициента корреляции, что может быть связано с изменениями функционального состояния коры.

r=0,83

1мм

1мм

1мм

r=0,5

Рис. 12 Результаты оптического картирования первичной зрительной коры крысы. Области интереса с ответом коры на стимулы с разными контрастами.

Стабильность регистрации позволила провести эксперименты, направленные на выявление закономерностей в изменении силы реакции первичной зрительной коры крысы в ответ на изменения контраста зрительного стимула (Рис. 12). Так, при уменьшении контрастности в 2 раза от максимальной фиксировали некоторое ухудшение силы ответа (r =0,83). При последующем кратном изменении контраста сигнал становился практически неразличим среди шума, корреляция с ответом при максимальных значениях контрастности составляла 50%. В то же время, повторное использование первоначальных значений стимула (через час) приводит к получению хорошо структурированного ответа с r = 0,9. Наличие ответа вместе со стабильным состоянием животного говорит о восприимчивости зрительной системы данного вида грызунов к изменению контраста зрительного стимула.

МОНИТОР

Рис.13 Фунциональная карта с ответом на ориентационную решетку

1мм

В некоторых случаях при недостаточной или неявной активации зрительной коры в ответ на стимул-полоску изменяли протокол стимуляции и предъявляли вращающийся ориентационный стимул, который по нашей гипотезе должен был сильно активировать зрительную кору. В итоге установили границы зрительной области (Рис.13). К цветовой градации в данном случае следует относиться с осторожностью – в данном случае имеет место запрограммированный способ представления данных, при котором происходит выделение областей, имеющих одинаковый сдвиг по фазе, но это не однозначно связано с топическим принципом организации коры, который на предыдущих слайдах кодировался спектральным градиентом. Однако наличие активации при использовании данного стимула является закономерным, что, в частности, подтверждается литературными данными – до 80% клеток зрительной коры крысы чувствительны к ориентации стимула. При этом показано, что чувствительные к определённой ориентации клетки в коре крысы размещены хаотично (перемешаны) [20], а не собраны в вертикальные колонки, как, например, у хищных млекопитающих, когда каждая клетка колонки преимущественно отвечает на одну и ту же ориентацию линии, а клетки соседней колонки могут реагировать уже на совершенно другую ориентацию.

Эксперименты по исследованию влияния контраста зрительного стимула на силу реакции нейронных популяций показали перспективность использования оптического картирования по внутреннему сигналу для объективного тестирования работы зрительной коры. Для более детального исследования была проведена серия экспериментов на 7 кошках, в которой проводили анализ фазовых и амплитудных функциональных карт ориентационной и дирекциональной чувствительности.

На рис. 14 представлены кривые, отражающие закономерности изменения силы отклика в зависимости от контраста зрительного стимула. Данные приведены отдельно для каждого животного. Значения амплитуды оптического сигнала усредняли для двух областей интереса, которые были расположены в полушариях мозга, ипси- либо контралатеральных по отношению к стимулируемому глазу.

Используемая методика позволяет одновременно получать оптические карты для ориентационной чувствительности (кривые обозначенные кружками) и дирекциональной чувствительности (кривые обозначенные треугольниками). В первую очередь следует отметить, что усредненные кривые для амплитуды оптического сигнала различаются средним значениям. Так, в экспериментах «c013» и «c015» (см. соответствующие пометки на графиках нижнего ряда рис. ) наблюдался высоких уровень значений для амплитуды, тогда как в эксперименте «c014» значения амплитуды оптического сигнала были минимальными. Сила оптического отклика для контра- и ипсилатерального полушария, за редким исключением (эксперимент «c012»), не обнаруживала значительных отличий. Предварительно можно отметить тенденцию, указывающую на то, что амплитуда сигнала, полученная по дирекциональным функциональным картам, снижена по отношению к отклику, наблюдаемому в ориентационных картах. Наиболее ярко эта закономерность может быть прослежена в эксперименте «c010», где амплитуда дирекционального сигнала в два раза снижена по отношению к ориентационному.

Рис. 14 Индивидуальные графики зависимости силы оптического сигнала от контраста зрительного стимула, представляющего собой решетку с пространственной частотой 0.2 цикл/градус. Кривые, обозначенные кружками, соответствуют данным по амплитуде ориентационных карт, а треугольниками – данным, отражающим чувствительность к направлению движения зрительного стимула. Измерения в каждом эксперименте проводили для двух областей интереса: ипси- и контралатеральной по отношению к стимулируемому глазу.

Несмотря на индивидуальные различия во всех экспериментах, четко прослеживается зависимость силы оптического ответа от контраста зрительного стимула.

Рис. 15 Нормированные усредненные кривые зависимости силы оптического сигнала от уровня контраста зрительного стимула. Данные 7 экспериментов. Обозначения см. рис. 14. Графическое отображение величины ошибки представляет собой стандартное отклонение.

Так, для крайних значений контраста (0.8 и 100%) наблюдается в среднем двукратное снижение амплитуды оптического отклика. Для построения усредненных графиков по всем экспериментам данные нормировали относительно значения амплитуды, вычисленного при усреднении функциональной карты, которая была получена в ответ на предъявление стимула с уровнем контраста 100% в контралатеральном по отношению к стимулируемому глазу полушарии. Фоновое значение не превышает значения 0.2. Усредненные данные приведены на рисунке 15.

Таким образом, подтверждаются наблюдения, произведенные на отдельных животных: четко прослеживается закономерность изменения силы оптического сигнала в зависимости от контраста зрительного стимула.

Проведя серию экспериментов с изменением пространственных частот, мы выявили четкую границу в разделении активации зрительных полей. Так, при значении 0.2 цикл/градус одинаково активируется 18-ое и 17-ое поля. Пространственная частота 0.8 цикл/градус позволяет активировать 17-ое поле (Рис. 16) и практически не вызывает оптического отклика поля 18.

а)

б)

1 мм

1 мм

Рис. 16 Амплитудные карты с активированными зрительными полями, а) 17-ым и 18-ым, б) 17-ым

Такое различие в ответе на стимулы разной пространственной частоты связано с особенностями строения сетчатки и организацией наружного коленчатого тела. Известно два пути обработки зрительной информации: X- и Y-пути. Можно заметить, что более быстро проводящие Y-пути приходят в стриарную кору, т.е. место, где идет первичная обработка информации, которая нужна для определения границ объектов.

«pinweel»

Рис. 17 Фазовая карта с популяционным ответом на ориентационную решетку слева, и справа увеличенный фрагмент, показывающий гиперколонку.

Обработка карт программой Калацкого позволяет еще раз убедиться и увидеть функциональную единицу первичной зрительной коры – колонку, а также структуру гиперколонки. На рисунке 17 видны колонки, где каждая имеет цвет, соответствующий ориентации решётки (синий цвет означает начало цикла стимуляции, когда на экране вертикаль, т.е. 0°), образующие гиперколонку с так называемым «pinweel».