§ 3.3 Используемые материалы

В исследованиях использовалась цельная кровь, взятая из вены здорового человека в 4 шприца, по 9мл в каждый. До взятия крови в каждый из шприцов были добавлены следующие вещества:

1. гепарин – 1мл;

2. гепарин – 1 мл, стандартный раствор антипептидаз объемом 50, 250 и 500 мкл для различных серий экспериментов;

3. гепарин – 1 мл, стандартный раствора антипептидаз объемом 250, 500 и 1000 мкл для различных серий экспериментов;

4. гепарин – 1мл, в первой серии экспериментов – 1 мл цитрата натрия; во второй и третьей серии экспериментов – этиловый спирт объемом 500 мкл и 100 мкл соответственно.

Из шприцов подготовленная таким образом кровь, выливалась в пробирки с соответствующей нумерацией.

Для подготовки этих проб крови использовались следующие растворы:

• раствор Рингера (300 мОсм):

Дистиллированная вода 100 мл;

NaCl 6,8 г/л * 100 мл = 0,68 г;

KCl 0,22 г/л * 100 мл = 0,022 г;

CaCl₂ 0,11 г/л * 100 мл = 0,011 г;

NaHCO₃ 0,17 г/л * 100 мл = 0,017 г.

• раствор цитрата натрия (300 мОсм):

Дистиллированная вода 50 мл;

Цитрат Na (50 г / 100 %) * 3,8 % = 1,9 г.

§ 3.4 Методики проведения экспериментальных работ

• Получение временного хода концентрации глюкозы для каждой пробы, приготовленной по описанию в § 3.3 «Используемые материалы», включало в себя получение 10-12 экспериментальных точек за 3 часа. Перед началом эксперимента концентрацию глюкозы измеряли в капле крови, взятой из пальца того же человека. Это измерение производится гораздо быстрее, чем аналогичное измерение для пробы крови, взятой из вены. Поэтому полученное значение концентрации глюкозы в плазме крови, взятой из пальца, можно считать наиболее близким к in vivo. В сериях экспериментов интервалы между получаемыми точками варьировались в зависимости от поставленной цели. Когда требовалось убедиться в наличии колебаний в пробе крови, вызванных быстрыми осмотическими процессами, происходящими за время, меньшее характерного времени прохождения глюкозы в эритроцит (10 мин) [19], то интервалы устанавливались менее 10 мин. Когда этого не требовалось, то интервалы устанавливались большие.

Так как показания глюкометра иногда были нестабильны и наблюдались выбросы (как в сторону уменьшения, так и в сторону увеличения показаний), то для устранения ошибок для каждой точки проводилось по 2 измерения, а если показания прибора при этом не совпадали в определенных пределах, то проводили и третье измерение. В этом случае при формировании экспериментальной точки, усредняя ее по измеренным величинам, выброс не учитывался. Одно измерение концентрации глюкозы занимало ~40 сек, следовательно, получение одной экспериментальной точки, как правило, ~80 сек, а при наличие выброса ~120 сек.

Средняя ошибка одного измерения концентрации глюкозы определялась на стабилизированной крови посредством пяти измерений концентрации глюкозы в ней, и вычислялась по формуле (5): , где – значение концентрации глюкозы в каждом из пяти измерений, – среднее значение концентрации глюкозы по пяти измерениям, n – количество измерений.

• Методика наблюдения временного хода показателя гематокрита в пробах крови. Гематокритная центрифуга позволяет проводить измерение для 12 капилляров. Как правило, одновременно получали экспериментальные точки для 4 проб крови, при этом центрифугировали по 3 капилляра для каждой из проб. Если одновременно экспериментальная точка определялась для двух проб, то центрифугировали по 6 капилляров для каждой пробы крови. Усреднением по измеренным значениям (3-м или 6-ти капиллярам) показателя гематокрита получали экспериментальную точку и оценивали среднюю ошибку измерения по формуле (5).

Одно измерение показателя гематокрита занимало не менее 20 минут, поскольку включало набор крови в капилляры – 8-10 минут, центрифугирование – 5 минут, измерение длины столба осевших эритроцитов и полной длины столба крови в капилляре – 5 минут. Поэтому за 3 часа наблюдений получали 7-8 экспериментальных точек. Таким образом, получали ход величины показателя гематокрита, усредненный по возможным быстрым осмотическим колебаниям объема эритроцитов, если такие были.

• Методика наблюдения временного хода показателя кислотности рН в пробах крови. Одно измерение рН в плазме пробы крови занимало ~ 1 мин. Подготовка рН-метра к измерению рН следующей пробы крови занимало ~ 2 мин. За 3 часа наблюдений для каждой пробы крови было получено 6-8 точек.

• Методика измерения неспецифической проницаемости мембран эритроцитов проб крови для кислорода. С помощью прибора КИНОКС были выполнены отдельные измерения для регистрации факта перехода метаболизма эритроцитов из состояния, близкого к in vivo, в состояние с низкой концентрацией АТФ. В первой и второй серии экспериментов проницаемость мембран эритроцитов не измерялась. По данным этих серий было выяснено, через какое время t после взятия крови из организма параметр (концентрация глюкозы) относительно стабилизируется. В третьей серии первое измерение проницаемости проводилось через это время t для каждой из проб, а второе ее измерение проводилось через 3 часа после начала эксперимента. Характерное время получения кривой оксигенации составляло ~ 8 мин.

Инструментальная погрешность отдельного измерения, оцененная в других исследованиях, составляла менее 1%. Случайный разброс от образцов крови получен в предыдущих исследованиях с данным прибором, составляет несколько больше (1-2%).