Глава 3. Экспериментальная часть § 3.1 Цели экспериментальных работ

• Регистрация осмотического сжатия эритроцитов пробы крови, непосредственно после ее взятия из организма, которое дает начало неравновесным процессам установления нового уровня метаболизма эритроцитов.

• Регистрация колебательных процессов при установлении нового уровня метаболизма, обусловленных рассогласованием процессов, определяющих кинетику гомеостатирования основных параметров эритроцитов.

• Регистрация факта совершившегося перехода метаболизма эритроцитов из состояния с высокой концентрацией АТФ в состояние с низкой его концентрацией по выявлению отличий параметров различных проб крови.

Для достижения поставленных целей были проведены следующие экспериментальные работы:

1. Наблюдение временного хода концентрации глюкозы n_гл в плазме пробы крови, которое позволило по изменениям величины n_гл судить о скорости синтеза АТФ в эритроцитах, а также о протекании осмотических процессов в пробе крови, которые происходят на временах меньших характерного времени прохождения глюкозы в эритроцит (10 мин).

2. Наблюдение временного хода показателя гематокрита Н пробы крови, которое позволило по изменениям величины Н судить о протекании осмотических процессов в пробе крови, идущих с характерными временами выше и сравнимыми с 15 мин.

3. Наблюдение временного хода показателя кислотности рН плазмы пробы крови, которое позволило по изменению величины рН судить об изменении интенсивности энерговыделений в цитоплазме эритроцитов, изменении величины трансмембранной разности потенциалов и, следовательно, об изменении неспецифической проницаемости мембран эритроцитов.

4. Измерение неспецифической проницаемости мембран эритроцитов, которое позволило по величине этого параметра судить о величине трансмембранной разности потенциалов и, в конечном итоге, об изменении уровня метаболизма эритроцитов и изменении концентрации АТФ.

§ 3.2 Используемые приборы и установки

1. Для измерения концентрации глюкозы в плазме крови использовался глюкометр IME-DC с одноразовыми полосками, принцип действия которого основан на измерении электропроводности пробы крови. Время одного измерения ~ 40 сек.

Подготовка глюкометра к экспериментам включала проверку его работоспособности согласно инструкции. До проведения эксперимента брали каплю крови из пальца здорового человека на специальную полоску. Затем с помощью прибора определяли концентрацию глюкозы в плазме крови этой капли. Если показания прибора попадали в физиологический диапазон значений измеряемой величины, то считалось, что прибор работоспособен.

2. Для измерения показателя гематокрита пробы крови использовалась гематокритная центрифуга СМ-70 sky line. Частота вращения – 5000 об/мин, время центрифугирования – 5 мин.

Подготовка гематокритной центрифуги СМ-70 sky line. Для работы центрифуги использовались гепаринизированные капилляры длиной 75 мм, объемом – 60-75 мкл. Для закупорки одной стороны капилляров использовался пластилин.

3. Для измерения показателя кислотности рН использовался рН-метр с водородным электродом. Время одного измерения ~ 5мин.

Для подготовки к эксперименту была снята калибровочная кривая рН-метра. Для этого использовались три стандартных раствора с известным рН: рН₁=10,01; рН₂=4,01; рН₃=7,01. Калибровочная кривая представлена на рис. 13. Она построена по трем точкам, которые получены для каждого из буферов путем усреднения по 5 измерениям рН. Погрешность каждой экспериментальной точки не превышает 1%.

4. Для измерения величины неспецифической проницаемости использовалась установка КИНОКС, которая включает в себя прибор КИНОКС (схема его действия представлена на рис. 14) и персональный компьютер.

Принцип действия прибора «КИНОКС»

В приборе КИНОКС наблюдается процесс обмена кислородом между цитоплазмой эритроцита и плазмой крови, в которую, в свою очередь, кислород поступает из контактирующей с кровью газовой среды. Основным параметром, регистрируемым прибором, является степень насыщенности крови кислородом, определяемая оптическим путем. В результате находят зависимость этой величины от времени. В результате анализа полученных зависимостей можно судить о кислородной проницаемости мембран эритроцитов крови [17, 18].

Основные узлы и элементы прибора «КИНОКС»:

1. Оптоэлектронный блок, включающий в себя светодиоды, работающие в красной и инфракрасной областях спектра (на длинах волн 0,65 мкм и 0,96 мкм соответственно), и фотодиод.

2. Кювета, выполненная из прозрачного материала (оргстекла).

3. Механическая мешалка с двумя лепестками, выполненными из гибкого пластика, толщину и жесткость которых можно варьировать.

4. Шаговый двигатель, с помощью которого вертится мешалка.

5. Термостат, позволяющий поддерживать температуру кюветы на уровне 27 ˚С.

В кювете имитируются процессы кислородного обмена между эритроцитами и тканями-потребителями кислорода. При этом взаимодействие эритроцитов со стенками кюветы и лепестками мешалки имитирует взаимодействие со стенками капилляров. Степень этого взаимодействия определяет величину неспецифической проницаемости мембран эритроцитов.

На рис. 15 представлена типичная кривая зависимости степени насыщенности крови кислородом от времени. Производная по времени в каждой точки данной кривой прямо коррелирует с величиной неспецифической проницаемости эритроцитарных мембран для кислорода.

Подготовка установки КИНОКС проводилась без использования пробы крови. Проверка его работоспособности включала запуск вращения мешалки. Если мешалка работает, то прибор готов к проверке действия программы управления экспериментом. При включении программы на дисплее ЭВМ должны появляться горизонтальные линии. Если прибор работоспособен, то эти линии со временем удлиняются и срабатывает команда на окончание работы прибора, когда заканчивается время, указанное программе.

Инструментальная погрешность отдельного измерения, оцененная в более ранних исследованиях, составляет менее 1%.