§ 2.3 Постановка экспериментальных задач

С целью экспериментальной проверки нашей гипотезы о возможности реализации двух устойчивых состояний метаболизма эритроцитов необходимо первоначально определить, каков их метаболизм эритроцитов in vitro после взятия пробы крови у пациента. Исследования необходимо проводить на цельной крови, что гарантирует наибольшее приближение к условиям in vivo. Для предотвращения свертывания крови следует использовать гепарин, добавление которого в кровь существенным образом не нарушает естественный ход процессов метаболизма эритроцитов. Возможно, при нарушении связи «кровь-организм» при взятии крови из организма будут протекать неравновесные процессы релаксации системы к новому состоянию. В конечном итоге метаболизм эритроцитов может оказаться в одном из двух, указанных выше, состояний.

§ 2.4 Неравновесные процессы, протекающие в плазме пробы крови после ее взятия у донора, приводящие к изменению метаболизма эритроцитов

Когда кровь находится в организме, все процессы метаболизма в эритроцитах согласованы, что соответствует точке 3 на рис. 8. После взятия пробы крови нарушается работа регуляторных механизмов, стабилизирующих процессы метаболизма клеток крови. Это происходит из-за распада сложных органических соединений в плазме крови в результате деятельности протеолитических ферментов (пептидаз). Поэтому для того, чтобы замедлить процессы ферментативного распада в лабораторной практике используют специальные вещества, ингибирующие эти процессы, – антипептидазы (ингибиторы протеолитических ферментов). Следствием деятельности пептидаз в плазме пробы крови является повышение ее осмолярности. В свою очередь такое повышение, если оно существенно по сравнению с уровнем осмолярности внутренней среды, гомеостатируемой в организме, может нарушить согласование равновесных процессов метаболизма эритроцитов, вызвав уменьшение объема эритроцитов. Соответственно, в плазме крови концентрации всех веществ, которые проходят через мембрану медленнее воды, понизятся, в том числе и концентрация глюкозы. Изменения объема эритроцитов и уровня глюкозы в плазме пробы крови можно контролировать с помощью известных приборов. В цитоплазме эритроцитов концентрации биологически активных веществ, таких как ферменты, регуляторные субстанции и др., не способных покинуть ее за время установления нового равновесия по воде, наоборот возрастут. Наиболее важным следствием протекания быстрых неравновесных процессов распада пептидов может оказаться повышение концентрации АТФ. Тогда дальнейшая цепочка причинно-следственных связей, приводящая к нарушению согласования метаболических процессов, будет следующая. Повышение концентрации АТФ вызовет усиление деятельности K⁺/Na⁺-АТФазы, которое приведет к повышению трансмембранной разности потенциалов. В свою очередь, такое изменение вызовет увеличение напряженности поля в липидах, а это, согласно работе М.В. Фока [15], приведет к уменьшению неспецифической проницаемости мембран эритроцитов для кислорода. Из-за высокой проницаемости цитомембран для ионов Н⁺ концентрации их между плазмой крови и цитоплазмой эритроцита устанавливаются практически в соответствии с соотношением Больцмана (4).

В организме рН плазмы крови гомеостатируется специальными системами, поддерживающими проточный гомеостаз баланса процессов подкисления (ацидоз) внутренней среды и ее подщелачивания (алкалоз). Алкалоз осуществляется, благодаря процессам, происходящим в легких, тонкой кишке и коже, а ацидоз обусловлен окислительными процессами во всех живых клетках. При взятии пробы крови связь между организмом и кровью в пробе прекращается. Генерируемая на мембране эритроцитов разность потенциалов между плазмой и цитоплазмой распределяется по буферной емкости указанных двух сред (~40% – плазма, ~60% – эритроциты). Поэтому, если какие-то процессы вызвали рост трансмембранной разности потенциалов, то рН плазмы крови понижается и, наоборот, при уменьшении трансмембранной разности потенциалов на мембране эритроцитов величина рН плазмы крови будет повышаться. Изменения величины рН плазмы крови можно контролировать с помощью известных приборов. Заметим, что после взятия пробы крови из организма плазма крови по вышесказанной причине подкисляется, и устанавливается новое равновесие по ионам Н⁺ между цитоплазмой и плазмой. рН плазмы при этом будет ниже, чем in vivo. Чем ниже установившееся значение рН плазмы крови, тем выше трансмембранная разность потенциалов на мембране эритроцитов пробы.

В свете рассмотренных выше цепочек причинно-следственных связей протекания процессов в крови, изменение кинетики энергетического метаболизма эритроцитов, в рамках нашей модели (рис.8), представляется смещением кривой MN на фазовой плоскости в кислую сторону. Если такое смещение имеет место, то нарушение согласования будет проявляться в появлении колебаний параметров эритроцитов и связанных с этим изменений концентрации глюкозы в плазме крови и объема эритроцитов. Наиболее значимо для нас колебание рН плазмы крови и цитоплазмы эритроцитов, так как эти колебания неизбежно вызывают быстрые неравновесные процессы ассоциации и диссоциации осмотически активных частиц. Следствием протекания осмотических процессов, в свою очередь, являются изменения концентрации глюкозы в плазме крови и объема эритроцитов, которые можно наблюдать, и по ним судить о появлении таких колебаний. Сродство отдельных соединений друг к другу и, следовательно, способность образовывать комплексы, может сильно зависеть от величины рН.

Таким образом, согласно нашей модели после взятия пробы крови рН плазмы устанавливается на более низком уровне, чем in vivo. Возрастание осмолярности плазмы крови вследствие деятельности пептидаз приводит к новому осмотическому равновесию, которому соответствует меньший объем эритроцитов и более высокая концентрация АТФ. При этом нарушается согласование метаболических процессов эритроцитов, что сопровождается колебаниями основных параметров рН, nАТФ. Рассмотренные причинно-следственные связи протекающих неравновесных процессов показывают, что при этом должны наблюдаться колебания концентрации глюкозы в плазме крови и объема эритроцитов. Временной ход величин этих параметров можно наблюдать на опыте.

Итак, процессы устойчивого подкисления цитоплазмы, напрямую не связанные с окислительными процессами утилизации глюкозы, способствуют переходу метаболизма эритроцитов в низкоэнергетическое состояние после взятия пробы крови.

Дальнейшие события могут развиваться по двум сценариям. В первом случае: подкисление цитоплазмы эритроцитов не достигает критического уровня, указанного в нашей модели (рис. 8). Тогда метаболизм эритроцитов останется на уровне, близком к in vivo, то есть будет соответствовать высокой концентрации АТФ, высокой величине трансмембранного потенциала и более низкому значению рН плазмы по отношению к рН in vivo. Но из-за рассогласования процессов неизбежны колебания основных параметров рН и nАТФ, а как их следствие, колебания измеряемых величин – концентрации глюкозы в плазме и объема эритроцитов. Кроме того, высоким значениям концентрации АТФ будут соответствовать высокие значения трансмембранного потенциала и низкие значения неспецифической проницаемости эритроцитарных мембран для кислорода.

Во втором случае: если рН цитоплазмы достигнет критически низкого уровня, то состояние метаболизма эритроцитов может потерять устойчивость. Тогда метаболизм эритроцитов перейдет в новое состояние, характеризующееся низкой концентрации АТФ, низкой величиной трансмембранного потенциала и меньшей скоростью подкисления цитоплазмы эритроцитов, чем в первом рассмотренном случае. Из-за рассогласования процессов неизбежны колебания основных параметров рН и nАТФ, и как их следствие, колебания измеряемых величин концентрации глюкозы в плазме и объема эритроцитов. Кроме того, низким значениям концентрации АТФ будут соответствовать низкие значения трансмембранного потенциала и высокие значения неспецифической проницаемости мембран для кислорода по сравнению с первым рассмотренным случаем.

Важным выводом теоретического исследования нашей качественной модели энергетического метаболизма эритроцитов является возможность перехода системы на другой устойчивый уровень вследствие протекания в ней естественных релаксационных процессов непосредственно после взятия пробы крови из организма. Поэтому в первую очередь необходимо проверить это положение. Основными критериями для установления состояния метаболизма, в котором находится эритроцит, являются различия следующих параметров в различных состояниях:

1. рН;

2. уровень глюкозы;

3. показатель гематокрита - объем

Различия в величинах этих параметров необходимо устанавливать, анализируя их временной ход после взятия пробы крови, так как мы не знали, осуществляется ли указанный переход вообще. Если переход происходит, то в какой момент времени. Надежно обнаружив и установив, что этот переход уже произошел и система близка к стационарному состоянию, то подтверждением будут различия в величине неспецифической проницаемости эритроцитарных мембран для двух установившихся вариантов устойчивого метаболизма.

Для того чтобы производить сравнения нужно получить пробу крови с состоянием метаболизма эритроцитов, близким к in vivo. Для этого необходимо устранить первопричину нарушения метаболизма эритроцитов – осмотическое неравновесие, возникающее после взятия пробы крови из организма. Для этого можно использовать препараты, ингибирующие ферментативный распад соединений в плазме крови (антипептидаз).

Для надежности полученных результатов при сравнении следует также получить пробу с заведомо низким энергетическим метаболизмом, добавляя в кровь препараты, ингибирующие гликолиз. Мы применяли этиловый спирт.

Объем исследований позволяет достигнуть поставленной цели и надежно установить возможность существования второго устойчивого состояния, либо его отсутствия.