Глава 7

РОЛЬ И ЗНАЧЕНИЕ ПЕПТИДОВ

В МЕХАНИЗМАХ АНГИОГЕНЕЗА

И ФОРМИРОВАНИЯ МИКРООКРУЖЕНИЯ

ОПУХОЛЕЙ

7.1. Теоретические предпосылки

Согласно существующим представлениям [8, 116], одной из особенностей злокачественных новообразований является утрата зависимости от внешних регуляторов и автономный рост, регулируемый локально продуцируемыми факторами. К числу аутокринных и паракринных регуляторов пролиферации опухолевых клеток относят так называемые факторы метаболического микроокружения опухолей, продуцируемые как опухолевыми клетками, так и окружающей их стро-мой и взаимодействующие с рецепторами на самой клетке-продуценте, либо на мембране соседней клетки [8, 31,139, 150]. Продуцируемые эндотелиальными клетками, моноцитами, макрофагами, лимфоцитами и тучными клетками ин-терлейкины, простагландины и биогенные амины прямо или косвенно влияют на пролиферацию и индуцированную гибель опухолевых клеток. Результаты многочисленных экспериментальных исследований свидетельствуют о непосредственном участии клеток микроокружения опухолей в патогенезе злокачественного роста [29, 30, 65, 97, 98, 120, 125, 147, 148, 157] и их влиянии на чувствительность и ответ опухолевых клеток к той или иной методике лечения [62, 66, 69].

Одним из перспективных направлений современной онкологии является биологическая терапия опухолей с применением препаратов, повышающих иммунную защиту организма и усиливающих прямой противоопухолевый эффект [74]. В этом плане широко изучаются эндогенные препараты, обладающие антипролиферативным действием (а- и р~ин-терферон, онкостатин, ингибиторы стволовых клеток — MIP (macrophage inflammatory protein)), иммуномодулирующими свойствами (интерлейкины), цитотоксическими эффектами (у-интерферон, туморонекротический фактор) и антиангио-

149

генным действием (ангиостатин, тканевые ингибиторы ме-таллопротеиназы, ингибиторы коллагеназы, тромбоспон-дин, сурамин, фумагиллин и др.), а также колониестимули-рующие и гематопоэтические факторы роста для коррекции побочных эффектов, которые возникают при использовании химиопрепаратов. В настоящее время биологическая терапия рассматривается как четвертая методика лечения опухолевой болезни [51, 102], основным направлением которой является уход от неспецифического воздействия на иммунные механизмы к применению биопрепаратов, которые способны активировать эндогенные защитные механизмы организма специфическим действием на иммунную систему [104].

Систематический анализ данных литературы о методах биологической терапии опухолей свидетельствует о том, что в последние годы особое внимание уделяется антиангиоген-ной опухолевой терапии [33, 38, 40, 45, 50, 54, 67, 93, 107, 114, 115, 121, 154]. Одной из главных предпосылок разрабатываемой стратегии антиангиогенной терапии является особенность ангиоархитектоники солидных злокачественных опухолей. Известно, что некоторые опухоли могут длительно существовать в так называемом «латентном» или «спящем» состоянии. При этом скорость их клеточной пролиферации практически полностью сбалансирована уровнем апоптоти-ческой гибели. В 70-х гг. XX в. впервые было высказано предположение, что рост опухолей размером более нескольких миллиметров в диаметре зависит от формирования в ней микроциркуляторного русла. Уже к концу 80-х гг. XX в. были получены строгие доказательства, что рост опухоли полностью зависит от неоваскуляризации, а метастатические клетки распространяются только после того, как в опухоли сформировалось ее сосудистое русло [99]. В настоящее время ан-гиогенез рассматривают как ключевой патогенетический этап в процессе опухолевого роста, инвазии опухолевых клеток и их метастазирования [15, 32, 58, 60, 67, 78, 84, 94, 99, 122, 129, 145, 146, 149], однако механизм, с помощью которого опухоли переключаются на «ангиогенный фенотип», остается не выясненным [126].

По данным литературы, уже в первые часы после имплантации опухолевых клеток в тканях развивается сосудистая реакция [6]. При этом из микрососудов окружающих тканей образуются капилляры, которые врастают в опухолевый зачаток и становятся основой опухолевой стромы. Отмечается, что способностью стимулировать пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток с образованием новых крове-150

носных капилляров обладают сложные гликопротеидные комплексы с ангиогенной активностью. Кроме того, в регуляции ангиогенеза важная роль принадлежит местной реакции в виде неспецифического асептического воспаления, предшествующей росту опухолевого зачатка. Исследования последних лет предполагают, что первичным стимулом вас-куляризации солидных опухолей является экспрессия сосудистого эндотелиального фактора роста, индуцированная онкогенными мутациями в опухолевых клетках и потенцируемая гипоксическими условиями внутри опухолевой паренхимы [42].

По современным представлениям, каскад ангиогенных событий зависит от сложных процессов, включающих межклеточные взаимодействия, различные внутриклеточные сигнальные пути и соответствующее внеклеточное микроокружение. Ангиогенез, индуцированный новообразованием, необходим для оксигенации и доставки в паренхиму опухоли необходимых для ее жизнедеятельности метаболитов и увеличивает вероятность гематогенного распространения метастатических клеток. Следовательно, ангиогенез представляет неотъемлемый процесс прогрессии опухоли, включающий ее рост и изменение фенотипических характеристик, определяющих инвазию и метастазирование. Прогрессирующее увеличение числа кровеносных сосудов в опухоли и взаимная поддержка экспансии опухоли новообразованными кровеносными сосудами ведет к не заканчивающемуся циклу, способствующему росту солидных опухолей. В настоящее время идентифицировано несколько молекулярных и клеточных механизмов, с помощью которых паренхима опухоли может проявлять ангиогенное действие на эндотелиальные клетки организма. В результате паракринного влияния эндотелиальные клетки, ассоциированные с опухолью, приобретают «незрелый» фенотип, который проявляется ускоренной миграцией и пролиферацией, высвобождением протеаз и экспрессией ряда цитокинов, например, эндотелий-специфической тирозинкиназы и интерлейкина 6. Как следствие, в опухолевой массе формируется сеть структурно и функционально аберрантных сосудов. В свою очередь секретируемые эндоте-лиальными клетками цитокины могут способствовать опухолевой прогрессии, подавляя рост менее агрессивных опухолевых клеток и активизируя их злокачественные аналоги в стратегически важных периваскулярных зонах [129].

Становится все более очевидным, что факторы, интерферирующие с формированием кровеносных сосудов, пред-

151

ставляют особый интерес для разработки новых методов и подходов для противоопухолевой терапии. Около 30 лет назад вмешательство в опухолевый ангиогенез рассматривалось как потенциальная терапевтическая стратегия. В настоящее время разработаны и прошли клинические испытания новые методы терапии опухолей, которые включают использование антиангиогенных препаратов: антагонистов ангиогенных факторов роста и ангиогенных рецепторов, ингибиторов пролиферативной активности эндотелиальных клеток, инак-тиваторов протеолитических ферментов и матричных метал-лопротеиназ, а также применение токсичных неспецифических средств для эндотелия сосудов опухолей и низкие дозы химиотерапевтических препаратов [63, 73, 75. 149]. Проводятся экспериментальные исследования применения ингибиторов ангиогенеза для преодоления приобретенной опухолевыми клетками множественной лекарственной устойчивости к химиопрепаратам [40, 43, 89].

Необходимо отметить, что одной из характерных особенностей злокачественных новообразований, определяющих, в том числе и лекарственную устойчивость, является клоновая эволюция как следствие двух антагонистических сил, действующих на популяцию опухолевых клеток [69, 117, 123, 133]. Первая из них обусловливает дивергенцию клеток через генетическую и эпигенетическую нестабильность, являющуюся врожденной характеристикой злокачественных клеток. Возможные причины генетической нестабильности включают ошибки в синтезе и аномальную репарацию ДНК, высокую скорость рекомбинаций и частое нерасхождение хромосом в митозе как следствие генного дисбаланса и неправильного метилирования ДНК. Вторая сила формирует гетерогенные фенотипы опухолевых клеток с конкуренцией за метаболиты и кислород и обеспечивает взаимодействие с микроокружением нормальных тканей.

Следует подчеркнуть, что взаимодействия между опухолью и организмом носят комплексный характер и на многие их аспекты влияют как биологические характеристики новообразования, так и системные компенсаторно-приспособительные процессы, определяющие резистентность организма к опухолевому росту. Наиболее общей особенностью всех злокачественных опухолей является вмешательство в обмен веществ организма, индуцирующее различные биохимические, эндокринные и иммунные нарушения гомеостаза, которые лежат в основе многих опухолевых синдромов [22, 31]. Опухолевые клетки имеют повышенный обмен веществ,

152

успешно конкурируют с нормальными тканями за жизненно важные метаболиты и действуют как метаболические ловушки, впитывая жизненно важные компоненты, необходимые для обмена веществ организма. В зависимости от типа растущей опухоли раковые клетки используют для своих энергетических или биосинтетических потребностей преимущественно глюкозу или аминокислоты. Кроме того, они могут высвобождать продукты своего метаболизма, которые обычно не продуцируются нормальной клеткой до малигнизации. Некоторые из этих веществ оказывают неблагоприятное влияние на обмен веществ организма и противодействуют метаболическим ответам, которые поддерживают гомеостаз. В результате особый метаболический механизм позволяет расти опухолевым клеткам непрерывно и неуправляемым способом. Последствия опухолевого роста на обмен веществ разнообразны. Однако все они ведут к одному: стрессовой ситуации, перенапряжению физиологических систем и снижению метаболической эффективности организма. Мышечное белковое истощение, усиленный глюконеогенез и разобщение окислительного фосфорилирования составляют основной комплекс метаболических нарушений в опухолевом организме. Результатом всех этих метаболических изменений является глубокий энергетический дисбаланс, который обычно заканчивается кахексией и в конечном счете гибелью организма.

Установлено, что на характер взаимоотношений организма и опухоли влияют многие факторы и/или механизмы: особые свойства опухолевых клеток, их микроокружение, компоненты неспецифической и специфической резистентно-сти, а также клеточные и гуморальные иммунные реакции против опухолевых клеток [37, 55, 61, 87, 132, 138]. В настоящее время факт реакции иммунной системы на рост опухолей не вызывает сомнений, хотя и отмечается, что в этой области иммунологии слишком многое основывается на предположениях и теоретических построениях [28]. Очевидно, что эффективный противоопухолевый иммунитет зависит от идентификации опухолевых антигенов, которые сигнализируют о чужеродное™ или агрессивности. В процессе злокачественной трансформации клеток белковые продукты аберрантной экспрессии мутантных генов потенциально имму-ногенны и могут служить в качестве антигенов отторжения [138]. Однако, несмотря на то что опухолевые клетки несут антигены, способные активировать цитотоксические Т-лим-фоциты и вызывать образование антител, многие опухоли

153

способны избегать механизмов иммунного надзора и не разрушаться факторами иммунной системы. Объяснение иммунного дефицита против опухолевой агрессии было достаточно трудной задачей, поскольку не существует единого механизма, который бы объяснял сложные иммунные взаимодействия между организмом и опухолью. Фактически все процессы, вовлеченные в эти взаимодействия, включены в патогенез иммунодефицитного ответа [28]. Помимо множественных механизмов «ухода» от иммунных факторов, существуют механизмы защиты опухолевых клеток, основанные на индукции иммуносупрессии [142]. Так, опухолевые клетки выделяют цитокины, многие из которых подавляют иммунный ответ и снижают активность сформировавшихся иммунных механизмов. Есть основания полагать, что расшифровка и молекулярный анализ механизмов, лежащих в основе ухода опухолей от иммунного надзора, приведет к развитию новых стретегий для предотвращения у онкологических больных Т-клеточной иммуносупрессии, развитию новых им-мунотерапевтических мероприятий, способных потенциально предотвращать прогрессию злокачественных новообразований и их развитие [87].

Установлено, что особую роль в ответе организма на злокачественный рост играют биогенные амины и регуляторные пептиды, продуцируемые клетками диффузной нейроэндок-ринной системы, и нейроиммуноэндокринные механизмы регуляции гомеостатических процессов [34, 105, 108, 147, 158]. В этом плане характерными примерами являются биогенный амин — серотонин — и универсальный гормон ингибитор — соматостатин. Известно, что в органах пищеварительного тракта серотонинпродуцирующие клетки составляют около 50 % от всей популяции эндокринных клеток. В них синтезируется и запасается почти 90 % эндогенного серото-нина, являющегося предшественником одного из ключевых иммуномодулирующих гормонов — мелатонина [95, 96]. По данным литературы, при физиологических концентрациях серотонин обладает митогенным действием, а в конце 80-х годов появились сведения о том, что он совместно с тумо-ронекротическим фактором принимает непосредственное участие в механизмах индуцированной гибели опухолевых клеток [105]. В настоящее время синтезированы аналоги со-матостатина, обладающие выраженной противоопухолевой активностью, и подробно изучены механизмы, которые основаны на их антипролиферативном действии и индукции апоптоза [128]. Есть данные, что антагонистические отноше-

154

ния между опухолевым процессом и интегративными нейро-иммуноэндокринными механизмами сопровождаются как становлением, так и разрушением на определенных этапах их взаимодействия функционально-корреляционных связей. Согласно проведенным исследованиям, неопластический процесс влияет на морфофункциональное состояние нейро-эндокринных клеток, а физиологически активные вещества, продуцируемые этими клетками, принимают участие в эндогенных механизмах опухолевого роста. Предполагается, что сочетанное применение обычных иммуностимуляторов с дополнительной гормональной стимуляцией иммунных механизмов даст весомое преимущество при комбинированных схемах иммунотерапии рака [37].

Целенаправленные поиски средств активации иммунного ответа организма на развивающуюся опухоль, устранения су-прессорного влияния опухолевых клеток на иммунную систему и подавления прогрессирующего роста новообразований начались в 70-е годы, а 90-е годы стали началом стратегического прогресса в лечении онкологических больных методами биологической терапии [74]. Наряду с идентификацией онкогенов, играющих ключевую роль в патогенезе злокачественного роста, получены положительные результаты при разработке противоопухолевых вакцин [39, 151], мо-ноклональных антител для терапии рака [47], а также в ходе лечения цитокинами, в том числе а- и у-интерфероном, фактором некроза опухоли и интерлейкинами [36,44, 54, 86, 100, 102, 103, 131, 141, 143, 153].

Иммунные подходы к лечению злокачественных новообразований основаны либо на активной, либо на пассивной иммунотерапии [49, 76]. При активной иммунотерапии лечение предполагает стимуляцию иммунной системы организма in vivo путем введения модификаторов биологических реакций: стимуляторов, цитокинов и противоопухолевых вакцин для усиления реакции против опухолей. При пассивной иммунотерапии лечение включает доставку биологических реагентов с иммунной реактивностью (антитела или клетки), которые могут прямо или косвенно переносить противоопухолевые эффекты и не обязательно зависят от интакткой иммунной системы организма. Для ослабления общетоксического действия цитокинов развиваются специальные пути, например, адоптивная (adoptive — приемный) цитокинотера-пия, суть которой состоит в обработке цитокинами мононук-леаров крови онкологического больного с целью индукции дифференцировки эффекторных клеток и последующей ин-

155

фузии их в организм пациента [28, 49]. Проводятся экспериментальные и клинические испытания протоколов генотера-пии новообразований [77]. Современные протоколы генной терапии позволяют увеличить толерантность онкологического больного к химиотерапии посредством пересадки в клетки костного мозга гена множественной лекарственной устойчивости; повысить иммуногенность опухоли при помощи трансфекции неопластических клеток генами локуса HLA; увеличить чувствительность опухолей к лечебным воздействиям путем прививки в трансформированные клетки генетических элементов, кодирующих активаторы цитостатиков и т. п. [20, 68, 109]. Однако эти виды терапии до сих пор не нашли широкого применения в онкологической практике.

Одним из перспективных направлений терапевтических мероприятий в онкологии является применение биомодуляторов, повышающих иммунную защиту организма и усиливающих, либо не противодействующих эффекту противоопухолевых химиопрепаратов [74, 83, 92, 100, 102, 103, ПО, 119, 141]. Для достижения выраженного лечебного эффекта большинство цитотоксических агентов, используемых в качестве противоопухолевых средств, применяются в дозах, которые близки к максимально переносимым [12]. Химио-иммунотерапия с применением цитотоксических препаратов, иммунорегуляторных лекарств и цитокинов представляет логичное сочетание двух форм терапий, имеющих различные механизмы действия и отсутствие наложения токсичности. Известно, что, с одной стороны, противоопухолевые препараты оказывают супрессорное действие не только на опухолевый рост, но и на гематоиммунологические функции организма. С другой стороны, иммунотерапия способствует потенциальному восстановлению дисфункции организма после химиотерапии, одновременно оказывая противоопухолевое действие путем формирования механизмов иммунной защиты. В принципе эти терапевтические методики являются комплиментарными.

Необходимо подчеркнуть, что в механизмах онкогенеза немаловажная роль принадлежит межклеточным взаимоотношениям, интегрирующим системный ответ организма на развитие злокачественных опухолей. Согласно современным представлениям, в интеграции адаптационных механизмов ключевая роль принадлежит регуляторным пептидам — ней-ротрансмиттерам, гормонам и иммуномодуляторам, выполняющим функции межклеточных и межтканевых молекул-посредников. Исходя из этого, представляется актуальным

156

проведение исследований по изучению возможности применения в онкологии эндогенных пептидов, повышающих иммунную защиту организма и оказывающих стабилизирующее действие на общий гомеостаз.

Результаты ранее проведенных нами исследований [16— 18] свидетельствуют о перспективности изучения в этом направлении синтетических пептидов — вилона и эпиталона. Комплексный морфофункциональный анализ показал, что вилон и эпиталон оказывают стабилизирующее действие на общий гомеостаз, стимулируют клеточный и гуморальный иммунитет, ускоряют восстановление микроциркуляторных нарушений и оказывают регулирующее влияние на межклеточные взаимоотношения. Для оценки возможности применения вилона и эпиталона в клинической практике нами проведено изучение биомодифицирующих свойств этих пептидов по отношению к росту, ангиогенезу и формированию микроокружения экспериментальных опухолей.

7.2. Методологические аспекты исследования

Работа выполнена на самцах белых беспородных крыс в возрасте 3 мес массой тела 180—200 г. Животные содержались в условиях вивария при естественном освещении и сбалансированном рационе питания, в весенний период времени.

В качестве объекта исследования использовали быстрорастущую соединительнотканную опухоль — саркому М-1 [21]. Известно, что саркома М-1 достаточно агрессивна и самопроизвольного рассасывания опухоли практически не наблюдается. Прививаемость этого типа новообразования на беспородных крыс составляет 70—100 % [7]. Как правило, животные с трансплантированной опухолью живут 4—5 нед. Результаты ранее проведенных нами исследований показали, что саркома М-1 представляет низкодифференцированную опухоль с высоким пролиферативным потенциалом и низким уровнем спонтанного апоптоза [26, 27].

Материал для имплантации получен от опухоли животного-донора. Ткань опухоли для перевивки выделена с соблюдением правил асептики. Отпрепарированную в капсуле опухоль переносили в чашку Петри с раствором Хенкса с добавлением 50 ЕД пенициллина. После удаления капсулы, геморрагических и некротизированных участков паренхиму опухоли разрезали на кусочки массой 5—6 мг. Затем с помо-

157

щью троакара кусочки опухоли вводили под кожу в правое эедро крыс. Чтобы обеспечить однородность опухолевого штамма в исследуемых группах материал от одной опухоли оыл введен 93 животным. После перевивки методом случайного отбора животные были распределены на 6 групп. 18 жи-вотных-опухоленосителей были включены в контрольную группу, по 15 — в каждую опытную группу: 1-я группа — контроль (животные с имплантированной саркомой М-1); 2-я группа — введение вилона с 1-х по 10-е сут роста саркомы в разовой дозе 0.5 мкг на животное-опухоленоситель (10 инъекций через 24 ч; общая доза на крысу — 5 мкг); 3-я группа — введение вилона с 12-х по 21-е сут в дозе 0.5 мкг (10 инъекций через 24 ч; общая доза — 5 мкг); 4-я группа — введение вилона с 1-х по 10-е сут в разовой дозе 5 мкг на животное-опухоленоситель (5 инъекций через 48 ч, общая доза на животное — 25 мкг); 5-я группа — введение вилона с 12-х по 21-е сут в дозе 5 мкг (5 инъекций через 48 ч, общая доза — 25 мкг); 6-я группа — введение эпиталона на 18—24-е сут роста саркомы семь дней подряд в разовой суточной дозе по 0.5 мкг на животное, общая доза 3.5 мкг.

Для повышения точности измерения размеров опухолей проведена депиляция кожи бедра кремом «Bocage» (Франция). Размеры опухолей на месте прививки определяли 2—3 раза в неделю и рассчитывали их объем по формуле эллипсоида:

К=4/Зях (1/2) х (D/2)²,

где L — длина опухоли, D = {D_l + D₂)/2, D_rn D₂ — два других взаимно перпендикулярных диаметра.

По динамике и дивергенции линий роста опухолей в испытуемых группах был определен срок для гистологического изучения саркомы. В контрольной группе животных материал для исследования брали на 16-е и 26-е сут роста опухолей; во 2-й и 4-й опытных группах — через 12 сут после окончания введения вилона; в 3-й и 5-й группах — через 1 сут после последней инъекции вилона; в 6-й опытной группе — через 2 сут после окончания введения эпиталона. В каждой опытной группе было отобрано по 5 крыс с объемами опухолей в диапазоне М ± а. Опухоли выделяли под нембуталовым наркозом (50 мг/кг). После завершения опытов крыс умерщвляли путем декапитации. Ткань опухоли вырезали в виде пластинок толщиной 3—4 мм, ориентированных вдоль длинной оси опухолевого узла, с возможным сохранением прилегающей

158

кожи. Кусочки фиксировали в течение 24 ч кислой жидкостью Буэна для светомикроскопических исследований и по Карновскому для электронной микроскопии. Обезвоженный материал заливали в парапласт для светооптических исследований и смесь эпонов для электронно-микроскопического изучения. Парапластовые срезы толщиной 7 мкм помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-Ь-лизина («Sigma»), Полутонкие срезы толщиной 1 мкм и ультратонкие срезы -70 нм готовились на ультрамикротоме LKB-7A (LKB). Ультратонкие срезы, контрастированные уранилаце-татом и цитратом свинца, изучали в электронном микроскопе JEM-100S (JEOL). Для ультраструктурного анализа были отсняты целые клетки и их фрагменты при первичных увеличениях на экране микроскопа от Х2100 до х 14 000.

Общую гистологию опухолей изучали на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, толуидиновым синим по Пирсу, по Ван-Гизону и трехцветным методом по Касону [23]. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим— азуром II—основным фуксином по методу Хамфри и Питма-на [80]. Тучные клетки селективно окрашивали 1%-ным раствором толуидинового синего («Fluka») при рН 0.5 [64].

Для иммуноокрашивания пролиферирующих клеток использовали мышиные моноклональные антитела к пролифе-ративному клеточному ядерному антигену — PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) при разведении 1 : 50 (клон РС10, Calbiochem) и авидин-биотин-пероксидазный набор для выявления мышиных иммуноглобулинов («Vectastain»). Адгезионную связь клеток саркомы с базальной мембраной эндотелия сосудов и их способность к локальной инвазии изучали с помощью поликлональных кроличьих антител к ламинину («Sigma») и биотин-стрептавидин-пероксидазного набора для кроличьих иммуноглобулинов. Серотониниммунопози-тивные клетки выявляли с помощью кроличьих антител к се-ротонину («BioGenex»). Для изучения перифокального иммунного ответа применяли набор для выявления крысиных иммуноглобулинов («BioGenex»). Экспрессию регуляторных пептидов в клетках микроокружения саркомы М-1 исследовали с применением кроличьих антител к вазоактивному ин-тестинальному пептиду — ВИП, бомбезину, соматостатину и энкефалину («Amersham»). Предварительно все антитела были протестированы на соответствующем позитивном контроле. Иммуногистохимическое выявление антигенов на гистологических срезах выполнено согласно основным требованиям для иммунопероксидазных методов [5, 11, 25, 127].

159

Функциональную активность опухолевых клеток изучали методом избирательной импрегнации ядрышковых организаторов [10, 79]. Апоптоз опухолевых клеток определяли по морфологическим критериям [134, 155, 156] на препаратах, импрегнированных по методу Мозера [113]. Этот метод представляет модификацию окрашивания гистологических срезов нитратом серебра в присутствии метенамина по Гомори. Модификация основана на эмпирически подобранных условиях, позволяющих избирательно импрегнировать серебром конденсирующийся хроматин погибающих клеток. Предварительно проведенный нами анализ показал, что количественные плотности апоптотических клеток на препаратах, окрашенных гематоксилином-эозином и импрегнированных по Мозеру, практически идентичны. Вместе с тем высокая селективность импрегнации позволяет более легко определять апоптоз и дифференцировать аноксические зоны, кон-турированные пикнотичными ядрами опухолевых клеток.

Индекс апоптоза (/_АП) и митотический индекс (/_мит) определяли по стандартной методике с иммерсионным увеличением микроскопа при анализе не менее 3000 ядер опухолевых клеток. Пролиферативный показатель по PCNA (/_PCna) определяли как отношение количественной плотности PCNA-позитивных ядер (iV_PCNA) к количественной плотности ядер опухолевых клеток (N_a0K), окрашенных гематоксилином. Количественную плотность определяли по числу сечений ядер на 1 мм² площади среза. Исследования по определению N_FCNA, N_n0K, и параметров зон ядрышковых организаторов (5_Я0 — средняя площадь сечения зон ядрышковых организаторов; р_яо — их объемная доля в ядре) выполнены с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений IMSTAR с применением прикладных лицензионных программ Morphostar-2 и Colquant-2, согласно основным принципам стереологии в морфометрии [2, 152]. Для каждого животного подсчет соответствующих структур проводили в 60 визуальных тестовых полях по трем срезам каждой исследуемой опухоли. В основу определения тестовой зоны для проведения сравнительного анализа количественных параметров в контрольной и экспериментальных группах были положены ранее полученные нами результаты изучения гистологического строения саркомы М-1 [27]. Чтобы избежать влияния факторов физиологического стресса, связанных со снижением доставки к опухолевым клеткам кислорода и питательных веществ, для количественных исследований тестовые поля располагали в периферических зо-

160

нах опухолей на расстоянии не более 1 мм от соединительнотканной капсулы и не менее 100 мкм от зон аноксии и некроза. Общая тестовая площадь для каждой опухоли составляла не менее 1.5 мм².

Параметры роста опухолей в контрольной и опытной группах определяли по 10 животным. Кинетику роста рассчитывали по уравнениям линий тренда для участков, соответствующих определенным стадиям развития саркомы М-1. Для изучения скорости прироста опухолей в интервале t_l—t_n вычисляли среднюю геометрическую

Рис. 7. Кинетика роста саркомы М-1 в контрольной группе по

уравнениям линий тренда.

По оси абсцисс — срок после имплантации опухолей, сут; по оси ординат — объем опухолей, см³. Прерывистые линии — линии тренда, а — экспоненциальная фаза роста в период 10—24 сут; б — линейный рост в период

28—40 сут.

ляет 0.64±0.06. В период 28—40 сут коэффициент скорости роста опухоли а соответствует 1.34, a G = 14.7±1.0. Средняя продолжительность жизни крыс после прививки опухолей — 37.4 сут (табл. 3).

В экспоненциальной фазе роста саркома М-1 представляла опухоль из веретенообразных и полиморфных клеток с явлениями тканевой и клеточной атипии. В зонах экспансивного роста опухолевые клетки располагались рыхло и часто имели фибробластоподобную форму. В участках солидного строения клетки саркомы плотно прилежат друг к другу, тесно контактируя между собой. От окружающих тканей опухолевые узлы отграничены тонкой соединительнотканной капсулой, инфильтрированной небольшим количеством [62

полиморфно-ядерных лейкоцитов. Характерной чертой ан-гиоархитектоники саркомы М-1 является зональная неоднородность развития сосудистого русла. Наиболее обильно были васкуляризированы периферические участки опухоли, прилегающие к здоровой ткани (рис. 8, а). От магистральных сосудов, располагающихся в подкожной клетчатке и капсуле опухоли, ответвлялись капиллярные петли, врастающие в паренхиму опухоли (рис. 8, б).

Возвращаясь к вопросу об особенностях ангиоархитекто-ники солидных злокачественных новообразований необходимо отметить, что морфофизиологически ангиогенез представляет несколько последовательных этапов, которые включают деградацию базальной мембраны протеолитическими ферментами, хемотаксис к стимулу и пролиферацию эндо-телиальных клеток, реканализацию, ветвление и формирования сосудистых петель, стабилизацию и функциональное созревание новых сосудов после периваскулярного присоединения перицитов, гладких мышечных клеток и синтеза компонентов базальной мембраны. Индукция образования новых сосудов опосредована опухолевыми клетками и метаболическими факторами их микроокружения Основные из них включают факторы роста эндотелиальных клеток, которые секретируются как опухолью, так и клетками ее микроокружения, и мобилизуются из внеклеточного матрикса с помощью протеаз, выделяемых опухолевыми клетками. Кроме того, регулирующие факторы включают продукты экспрессии онкогенов и супрессорных генов, некоторые компоненты внеклеточного матрикса, интегрины эндотелиальных клеток и гипоксию. Способность опухолевых клеток индуцировать ангиогенез связывают с выделяемыми ими и/или клетками стромы эндотелиального фактора роста, фактора роста фибробластов, простагландинов и активатора плазми-ногена [60]. Есть данные, что в индукции неоваскуляризации принимает участие гепарин, выделяемый концентрирующимися в зоне роста опухолей тучными клетками, который потенцирует действие ангиогенных факторов. Кроме того, как известно, тканевые тучные клетки генерируют множество медиаторов, включая гистамин, простагландин Z>₂ ^и лейкот-риены, которые индуцируют расширение сосудов и увеличивают их проницаемость [144].

По нашим наблюдениям, наиболее активно выраженной зоной ангиогенеза саркомы М-1 являлся ее подкапсульный участок. В этой зоне микроциркуляторное русло было представлено тонкостенными сосудами капиллярного и синусо-

163

идного типа, эндотелиальная стенка которых представляет пласт вытянутых, тесно контактирующих между собой клеток полигональной формы с неровными, извилистыми границами. При изучении сосудов достаточно часто идентифицируются PCNA-позитивные ядра эндотелиальных клеток (рис. 8, в). Строма очень скудная. На препаратах, окрашенных по Ван-Гизону и Массону, выявляются немногочисленные коллагеновые волокна, располагающиеся вдоль сосудов. При электронно-микроскопическом исследовании выявле-ны немногочисленные фибробласты, располагающиеся вдоль сосудов, единичные макрофаги и тучные клетки. Под слоем эндотелия располагалась уплотненная тонкофибриллярная базальная мембрана. Сосуды окружены перицитами и аморфным слоем межклеточного матрикса.

Характерной чертой саркомы М-1 является зональная неоднородность строения паренхимы. Активно пролифериру-ющие опухолевые клетки располагаются вдоль капсулы в достаточно узкой периферической зоне шириной от 1.5 до 4 мм. Однако даже в этой зоне обнаруживается полиморфизм структурно-функциональной организации неопластических клеток. Так, на препаратах, иммуноокрашенных на PCNA, наиболее интенсивно пролиферирующие клетки располагаются в периферической зоне (рис. 8, в), либо в виде «опухолевых розеток» вокруг сосудов. По нашим наблюдениям, в участках солидного строения паренхимы средняя интенсивность иммуноокрашивания ядер клеток саркомы на PCNA почти на 20 % ниже по сравнению с опухолевыми клетками, которые группируются вокруг сосудов. По-видимому, синтез этого внутриядерного белка достаточно чувствителен к концентрации поступающего в клетки кислорода. По предварительным подсчетам, по мере удаления тестовых полей от периферии опухолей определяется тенденция к снижению пролиферативного показателя по индексу PCNA. Однако существенной разницы в распределении по паренхиме делящихся клеток мы не обнаружили.

Общепринято мнение, что прогрессия опухолей во многом определяется их пролиферативной способностью. Изучению пролиферативной активности опухолевых клеток придается особое значение в связи с использованием этого параметра для прогнозирования реакции злокачественных новообразований на лучевую и лекарственную терапию [4]. В клинической практике и при экспериментальных исследованиях чаще всего для этих целей определяют митотический индекс, однако некоторые исследователи подчеркивают, что

164

прямая связь между митотической активностью и скоростью роста новообразований отсутствует [14]. В настоящее время для объективной оценки пролиферативного статуса опухолевых клеток применяют иммуногистохимическое выявление ядерных белков (циклинов), принимающих участие в подготовке клеточного деления [82]. К числу таких надежных маркеров относится PCNA [53,70]. Установлено, что PCNA синтезируется только в клетках с последующим удвоением ДНК. Этот дополнительный белок к 5-полимеразе ДНК появляется в ядрах делящихся клеток в середине G\ периода, максимальная экспрессия его происходит в S фазе и постепенно снижается к концу периода G₂, т. е. фактически индекс PCNA отражает фракцию пролиферирующих клеток.

В подкапсульной зоне опухолевые клетки располагаются рыхло и отделены друг от друга тонким слоем межклеточного матрикса. В участках солидного строения клетки саркомы плотно упакованы и тесно контактируют между собой. Форма ядер опухолевых клеток овальная, вытянутая, иногда неправильная. В ядрах выявляются 1—2 крупных ядрышка фибриллярной структуры. В цитоплазме опухолевых клеток обнаруживаются немногочисленные уплощенные цистерны гранулярной эндоплазматической сети, большое количество свободных рибосом и небольшие по размеру митохондрии. Отчетливо выражен ультраструктурный полиморфизм в виде темных и светлых клеток. На полутонких и ультратонких срезах хорошо дифференцируются многочисленные фигуры митоза и единичные клетки, погибающие путем апоптоза.

На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, центральные зоны опухолевых узлов представлены оксифи-льными полями некроза. Небольшие по размеру, удлиненной формы островки некроза обнаруживаются и по периферии опухолей. Следует отметить, что формирование спонтанного некроза является характерной чертой быстрорастущих опухолей. Это связано с неполноценностью ангиогенеза и образованием зон аноксии в опухолевой паренхиме. Считается, что при интегральной оценке степени прогрессии злокачественных новообразований учет фактора «потери» клеток является не менее важным, чем их способность к размножению. Для опухолей основными факторами «потери» являются некроз и апоптоз. В настоящее время морфологические и биохимические аспекты спонтанного развития некроза изучены достаточно хорошо [1]. Постулируется, что некроз развивается при токсическом шоке или в результате аноксии и характеризуется массовым инсультом клеток. В

165

отличие от некроза, апоптоз представляет активный процесс самоуничтожения, протекающий в отдельных клетках популяции. Термин апоптоз был впервые предложен в 1972 г. Керром с сотрудниками [91] для обозначения особого типа физиологической и патологической гибели клеток, морфологически отличающегося от некроза. Показано, что апопто-тическая гибель клеток может быть инициирована токсическими стимулами очень низкой интенсивности [52]. Выдвинута «генетическая» гипотеза о том, что физиологическая и индуцированная токсическими веществами и физическими факторами смерть клеток по механизму апоптоза осуществляется по особой программе, которая способствует элиминации клеток, несущих структурные критические повреждения ДНК [19].

По данным статмокинетических исследований, выполненных на мышиной саркоме, уровень апоптоза меняется по мере роста опухолей [134]. На ранних стадиях роста саркомы SaF гибель опухолевых клеток путем апоптоза сначала увеличивается, после достижения опухолями веса ~50 мг падает и затем сохраняется на одном уровне. При рассчитанной величине индекса апоптоза в 1.1 % он обусловливает около 7 % потери клеток от общей фракции гибнущих клеток в этой опухоли. Авторы высказали предположение, что изменение апоптотической активности отражает первоначальную попытку организма контролировать рост новообразования.

По нашим данным, для саркомы М-1 характерна выраженная зональная неоднородность распределения количественной плотности апоптоза. Для опухолей объемом 0.5— 1 см³ в периферической зоне определяется от 9 до 15 апо-птотических клеток (рис. 8, г) на 1 мм² площади паренхимы (/д_П = 0.3). В центральных участках опухолей в контрольные тестовые площади попадает до 40—50 апоптотических структур, иногда сконцентрированных в виде небольших групп. В экспоненциальной фазе роста саркомы в субкапсульной зоне определяется 3900—4300 опухолевых клеток на 1 мм². Индекс PCNA варьирует в диапазоне от 70 до 90 %. Однако в отдельных участках солидного строения снижается до 40—50 %. Митотический индекс находится в пределах 1.9—2.6 %, а индекс апоптоза составляет от 0.2 до 0.4 %.

На 26-е сут паренхима саркомы М-1 у животных 1-й группы сохраняла полиморфный гистеоидный тип строения. Несмотря на выраженный экспансивный характер роста признаков прорастания опухолевыми клетками соединитель-

166

нотканной капсулы не обнаружено. При этом обращало внимание, что в подкожной клетчатке над опухолью концентрируется значительное количество тучных клеток (рис. 8, д). Эти клетки интенсивно окрашены толуидиновым синим, имеют крупные размеры (S_TK ~ 90—100 мкм²), некоторые из них функционально активизированы и находятся в состоянии дегрануляции. В зоне ангиогенеза встречаются участки миграции тучных клеток в паренхиму опухоли вдоль волокон соединительнотканной стромы. Во многих работах показано, что вокруг зоны роста опухолей наблюдается достаточно выраженная тучноклеточная реакция [24, 29, 97, 124, 148]. По мнению некоторых исследователей, такой показатель может отражать участие тучных клеток в ингибировании пролифе-ративной активности опухолевых клеток.

В периферической зоне паренхимы, определяющей рост опухолей, митотический индекс опухолевых клеток составляет 2.28 %. Индекс апоптоза почти на порядок ниже — 0.28 % (табл. 3). По отношению индексов митотическая активность опухолевых клеток почти в 9 раз выше, чем их гибель путем апоптоза. По данным компьютерного анализа, количественная плотность опухолевых клеток по ядрам, окрашенным гематоксилином, соответствует 4220 на 1 мм², а пролиферативный показатель по индексу PCNA равен 76.5 %. Интенсивность иммуноокрашивания ядер на PCNA по оптической плотности равна 0.121 ±0.06. В ядрах определялись от 1 до 5 ядрышковых организаторов (ЯО) (рис. 8, е). Средняя площадь ЯО составила 2.70±0.08 мкм²; интегральное содержание ЯО в ядре равно 7.40±0.18 %.

В последние годы существенно повысился интерес к изучению функциональной активности опухолевых клеток путем определения зон ЯО. Область ЯО представляет участки вторичных перетяжек акроцентрических хромосом, где локализованы гены, кодирующие рибосомную РНК, и формируется ядрышко непосредственно после деления клетки [13]. В интерфазных ядрах зоны ЯО представляют участки активной транскрипции рРНК [112]. Данные литературы по сравнительному исследованию зон ЯО, степени злокачественности опухолей, транскрипционной активности РНК и экспрессии ядерных антигенов позволяют считать, что функциональная активизация ЯО в опухолевых клетках связана со злокачественной трансформацией клеток и коррелирует с их пролифе-ративным статусом [3, 13, 59]. С ядрышковыми организаторами связаны кислые негистоновые белки, принимающие участие в регуляции синтеза рРНК и образования рибосом.

167

Высокая плотность отрицательных зарядов кислых белков определяет их аргирофильные свойства, позволяющие использовать метод AgNOR. На препаратах, окрашенных коллоидным раствором нитрата серебра, зоны ЯО избирательно импрегнируются (рис. 8, ё). Высокая селективность окрашивания позволяет использовать автоматизированные методы компьютерного анализа изображений для определения точных количественных данных [118].

Результаты исследований показали, что ни в паренхиме, ни в тканях, окружающих опухоли, Ig-позитивные клетки не встречаются. При иммуноокрашивании на ламинин позитивный продукт реакции контурирует в основном стенку сосудов достаточно крупного калибра. Признаков локальной адгезии клеток саркомы к ламининпозитивным участкам ба-зальной мембраны и их инвазии в просвет сосудов не выявлено. Позитивная иммуногистохимическая реакция стромаль-ных клеток микроокружения на фактор роста опухоли, бом-безин, соматостатин и энкефалин не зарегистрирована. Слабая ВИП-подобная иммунореактивность выявлена вокруг отдельных магистральных сосудов дермы, но полностью отсутствует в подкапсульной зоне. В зоне ангиогенеза пери-васкулярно обнаружены единичные клетки с положительной реакцией на серотонин.

Действие вилона в дозе 0.5 мкг

в латентном периоде и экспоненциальной фазе

роста опухоли (2-я и 3-я группы)

У животных 2-й группы опухолевые узелки в зоне имплантации начали визуализироваться на 7—13-е сут после перевивки. У двух животных опухоли, достигнув объема 0.05—0.06 см³ (средний диаметр -5—6 мм), полностью регрессировали в течение нескольких последующих дней. У одной крысы опухоль не привилась. По данным сравнительного анализа, у 8 животных исследуемой группы кривые роста саркомы располагаются ниже линии роста опухолей в контрольной группе. До 24 сут существенных изменений в скорости роста опухолей по коэффициенту а не регистрируется. Однако обращает на себя внимание то, что прирост массы опухолей в этот период по средней геометрической снизился на 25 % и составил 0.48±0.09 (р > 0.05). Расхождение линий роста по средним значениям в контрольной и опытной группе было отмечено лишь через 2 нед после окончания введе-

168

ния вилона. По коэффициенту а уравнения линии тренда в интервале между 28 и 40 сут темп роста опухолей снижался в 1.7 раза, а прирост массы опухолей по средней геометрической уменьшался на 33.2 %. Различие становится достоверным по отношению к контрольной группе при/? = 0.05. Средняя продолжительность жизни животных-опухоленосителей во 2-й группе составила 40.5±3.4 сут (р > 0.5).

В группе животных с введением вилона в дозе 0.5 мкг в экспоненциальной фазе роста опухолевые узелки появились в зоне имплантации на 5—7-е сут (как и в контрольной группе). До 24 сут кинетические параметры роста саркомы в 3-й группе практически не отличались от контрольных значений. В экспоненциальной фазе диапазон варьирования индивидуального роста опухолей и кривые роста, построенные по средним значениям, практически совпадали. Коэффициент, который определяет кинетику роста по экспоненциальной зависимости, и прирост массы опухолей не отличались от аналогичных показателей, определенных для контрольной группы (табл. 3). В последующий период была отмечена тенденция к снижению скорости роста и прироста массы опухолей — коэффициент а снижается до значения 1.16, <J₂₈_40 ⁼ 13.56±1.63, однако различие с контрольными значениями не достоверно. Средняя продолжительность жизни животных-опухоленосителей в 3-й группе увеличилась до 42.3±3.6 сут (р > 0.5).

При изучении препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, на полутонких срезах существенных изменений в гистологическом строении опухолей после введения вилона в разовых дозах 0.5 мкг не выявлено. Ультраструктурная организация паренхимы саркомы также соответствовала вариантам контрольной группы. Однако обнаружена активизация клеток стромы. Так, например, чаще регистрировались клетки гранулоцитарного ряда типа моноцитов, тучные клетки и нейтрофильные лейкоциты (рис. 9).

Результаты гистохимических и иммуногистохимиче-ских исследований также практически полностью совпадали с данными по контрольной группе (табл. 3). В подкапсульной зоне количественная плотность опухолевых клеток во 2-й группе составляет 4080±190 на 1 мм², в 3-й группе — 4136±170. Пролиферативная активность по индексам PCNA оставалась столь же высокой, как и в контрольной группе. Вместе с тем, по данным компьютерного анализа, индекс апоптоза опухолевых клеток во 2-й группе увеличился до 0.33±0.02, а в 3-й группе составил 0.38±0.02.

169

7 Зак. №4312

Действие вилона в дозе 5.0 мкг

в латентном периоде и экспоненциальной фазе

роста опухоли (4-я и 5-я группы)

В 4-й группе латентный период времени до появления опухолевых узелков составил 6—7 дней, однако наблюдения над животными показали, что прививаемость саркомы в этой группе снизилась до 80 %. У двух крыс была зарегистрирована самопроизвольная регрессия привившихся опухолей. При анализе сравнительной динамики роста опухолей обращало внимание, что на 10—24-е сут у 5 из 7 животных-опухолено-сителей кривые роста саркомы располагались выше линии роста опухолей в контрольной группе. По данным количественного анализа, в экспоненциальной фазе прирост массы привившихся опухолей по средней геометрической был в 1.7 раза выше по сравнению с контрольной группой ((7₁₀_₂4 ⁼ 1.08±0.17), а в период 28—40 сут этот показатель превышал контрольные значения на 23 % (^28—40 ⁼ 18.05±2.5). Средняя продолжительность жизни животных после имплантации опухолей в этой группе составила 35.9±4.2 сут (р > 0.5).

В 5-й группе опухоль не привилась у одной крысы. В трех случаях после двух инъекций вилона в разовых дозах 5 мкг рост привившихся опухолей прекратился. В последующие несколько дней они полностью регрессировали. В интервале времени 10—24 сут существенных отклонений в характере роста отдельных опухолей от средних значений в контрольной группе не отмечено. Диапазон варьирования и кривые роста, построенные по средним значениям в основном совпадают. Не отличаются и количественные данные, полученные по уравнениям линий тренда. Однако на 5—7-е сут после окончания инъекций вилона у 4 животных кривые роста начали отклоняться от средних значений, характерных для контрольных животных. Замедленный темп роста опухолей сохранялся около 10 сут. По уравнению линии тренда в период 28—40 сут коэффициент а снизился на 20 %, а прирост массы опухолей уменьшился на 23 %. Средняя продолжительность жизни животных в 5-й группе составила 38.9±2.6 сут.

При изучении гистологического строения опухолей животных 4-й и 5-й групп обращают на себя внимание характерные изменения со стороны микроциркуляторного русла в капсуле и подкапсульной зоне (рис. 10). Просвет сосудов был расширен. Периваскулярно определялись характерные признаки отека с выходом форменных элементов крови в межклеточное пространство. В 5-й группе животных периваску-

170

лярный и интерстициальный отек был выражен в большей степени. Проведенный анализ гистологических препаратов позволяет предположить, что введение достаточно больших доз вилона, по-видимому, стимулирует гемодинамику в опухолях. При этом в ранние сроки на первый план выступает усиление кровенаполнения практически всех звеньев сосудистого русла в саркоме, а в более поздние сроки — активизируется ангиогенез.

Пролиферирующие опухолевые клетки были концентрически сгруппированы вокруг новообразующихся капилляров в виде небольших групп. По ультраструктурным характеристикам (крупные ядра с гипертрофированными ядрышками; цитоплазма, насыщенная свободными рибосомами, слабо развитый пластинчатый комплекс) клетки саркомы в 4-й и 5-й группах практически не отличались от опухолевых клеток контрольной группы. Тучные клетки и моноциты в зонах их дифференцировки тесно контактировали с опухолевыми клетками. У животных, получавших вилон в разовых дозах 5 мкг, было отмечено повышение митотической, пролиферативной и функциональной активности эндотелиальных клеток. Кроме того, по данным количественного анализа, в подкапсульной зоне была отмечена небольшая тенденция к усилению пролиферативной и функциональной активности опухолевых клеток (табл. 3). Однако вместе с этим увеличивался индекс апоптоза опухолевых клеток. В 4-й группе индекс апоптоза составил 0.43+0.07, в 5-й группе — 0.49±0.02 О< 0.05).

При иммуноокрашивании препаратов на ламинин существенных изменений в его экспрессии не выявлено. В то же время заметно возросло содержание серотонинпозитивных клеток в периваскулярной строме. Как и в контрольной группе, признаки экспрессии регуляторных пептидов в стромаль-ных клетках микроокружения отсутствуют. Практически не выявлялись клетки с позитивной реакцией на иммуноглобулины. В отличие от предыдущих групп, в 5-й группе животных отмечена повышенная дегрануляция тучных клеток в подкожной клетчатке, паретическое расширение сосудов капсулы и появление локальных микроочагов некроза в подкапсульной зоне опухолей.

При действии эпиталона на кинетику роста и функциональную морфологию саркомы М-1 отмечалось следующее. До 24 сут рост опухолей в 6-й опытной группе практически полностью соизмерим с контролем. Однако на 2—4-й день после окончания введения испытуемого препарата появляется от-

171

четливая дивергенция линий роста. В период 28—40 сут прирост массы опухолей по средней геометрической снизился на 26 % относительно контрольной группы (р < 0.05). По коэффициенту а скорость роста опухолей в группе животных, леченых эпиталоном, снижается в 1.5 раза (табл. 3). После 40 сут скорость роста опухолей начинает увеличиваться. При этом угол наклона кривой практически совпадает с контролем, а коэффициент а возрастает с 0.88 до 1.2. Средняя продолжительность жизни животных в этой опытной группе увеличилась на 20 % и составила 44.9±2.7 сут (р < 0.05).

Таким образом, по данным кинетических исследований, эпиталон достоверно замедляет рост саркомы М-1, а тормозящий эффект сохраняется в течение 2 нед после окончания курса введения препарата.

Микроскопически в трех опухолях этой группы обнаружено появление в периферических зонах обширных, протяженных очагов некроза с вовлечением сосудов (рис. 11, а). В этих зонах пролиферирующие клетки сохранялись в виде «опухолевых манжеток», а оставшаяся часть паренхимы была представлена полями недавно погибших клеток с пикнотич-ными ядрами. В двух случаях гистологический рисунок опухолей в целом мало отличался от контроля. Однако в подкап-сульной зоне крупные сосуды расширены, а в капиллярах видны признаки стаза крови. Кроме этого, в качестве характерного признака опухолей в этой группе можно отметить появление вокруг сосудов многочисленных клеток, окрашивающихся толуидиновым синим. В отдельных участках их количественная плотность достигала 90 на 1 мм² площади паренхимы опухоли. Клетки дали отчетливую позитивную им-муногистохимическую реакцию на серотонин. При использовании метода серийных полутонких — ультратонких срезов эти серотонинпозитивные клетки были идентифицированы как тучные клетки (рис. 11, г). По своим ультраструктурным и иммуногистохимическим характеристикам идентифицированный нами тип клеток фенотипически отличается от тучных клеток, концентрирующихся по периферии опухолей, и больше соответствует интраэпителиальным тучным клеткам желудочно-кишечного тракта. Ранее подобный тип тучных клеток в коже мышей был описан д'Рэем с сотрудниками [56] при изучении механизмов экспериментального канцерогенеза. Поэтому мы обозначили их как тучные клетки интратуморального типа. Детальное электронно-микроскопическое исследование показало, что после пролонгированного введения эпиталона основные события развер-

172

тываются в периваскулярной строме. Судя по увеличению содержания коллагеновых волокон, активизировалась деятельность фибробластов. В подкапсульных участках опухолей обнаружены многочисленные моноциты, являющиеся, как известно, предшественниками макрофагов, и, наряду с естественными киллерами, активированными Т-лимфоцитами и тучными клетками, обладающими противоопухолевой цито-токсичностью [65, 72].

При иммуноокрашивании препаратов на ламинин особых изменений в его экспрессии и характере контурирования стенок сосудов не обнаружено. Однако, обращало на себя внимание появление в периваскулярном пространстве бесклеточных участков в виде своеобразных «зон отчуждения». На электроннограммах эти участки были представлены в виде скопления прозрачных вакуолей, отделяющих базаль-ную мембрану эндотелия от прилегающих к сосудам опухолевых клеток, в цитоплазме которых появляются признаки ультраструктурной патологии, характерные для клеток, которые испытывают недостаток в кислороде: уплотняется цитоплазма, усиливается гетерогенность строения внутриклеточных органелл, развивается субтотальное набухание и отек митохондрий.

Известно, что базальная мембрана, являющаяся специализированным компонентом внеклеточного матрикса, в норме представляет собой непроницаемый барьер для большинства клеточных элементов (за исключением некоторых типов специализированных клеток) [41]. Это сложное структурно-функциональное образование рассматривают как важный фактор, определяющий прочность межклеточных связей, рост и дифференцировку клеток. В настоящее время ламини-ну — интегральному гликопротеину, представляющему основной компонент базальных мембран, отводится особая роль в регулировании клеточной адгезии и миграции, диффе-ренцировке и переносе информации от эффекторных клеток к иммунной системе. Полагают, что именно ламинин вовлечен в ряд событий, определяющих инвазию опухолевых клеток и процесс метастазирования [81]. Миграцию и инвазию опухолевых клеток рассматривают как мультиэтапные процессы [101]. Основным барьером для инвазии является базальная мембрана эндотелиальных клеток. На первом этапе опухолевая клетка, взаимодействуя с поверхностными рецепторами, специфически связывается с компонентами межклеточного матрикса. Затем, имитируя свойства «нормальной» клетки, прикрепившаяся опухолевая клетка начинает

173

секретировать (или стимулирует к секреции клетки организма-хозяина) гидролитические ферменты, которые способны разрушать матрикс базальной мембраны путем протеолиза. На следующем этапе опухолевая клетка мигрирует в просвет лимфатического или кровеносного сосуда. Показано, что адгезия опухолевых клеток к базальной мембране определяется экспрессией специфических рецепторов к ламинину и к IV типу коллагена, также входящему в состав базальных мембран, а ламинин способен как усиливать, так и ингибировать способность опухолевых клеток связываться с IV типом коллагена. По данным некоторых исследователей, адгезия опухолевых клеток к базальной мембране эндотелиальных клеток может приводить к защите опухолевых клеток от цито-токсического действия естественными киллерами [85].

Различают два типа клеточной адгезии: гомотипическая адгезия — величина, характеризующая соединение между клетками в опухоли (межклеточное сцепление), и гетероти-пжеская, отражающая взаимодействие поверхности опухолевой клетки со структурными элементами нормальной ткани [9]. Результаты проведенных нами исследований свидетельствуют о том, что для клеток саркомы М-1 более характерна гомотипическая адгезия и слабо выраженная «прилипае-мость» клеток к базальной мембране эндотелия сосудов. Не исключено, что образующиеся после введения эпиталона зоны «отчуждения» формируют дополнительный барьер для миграции опухолевых клеток через сосудистую стенку.

По результатам компьютерного анализа, в зонах активной пролиферации количественная плотность опухолевых клеток практически не отличается от контроля. Интенсивность им-муноокрашивания ядер на PCNA снижается лишь в области периваскулярного отека (рис. 11,6). Отмечена слабая тенденция к снижению пролиферативной активности опухолевых клеток по сравнению с контролем (/_PCna ⁼ 74.5 %, /_мит = = 1.9 %,р> 0.05). Однако в зоне ангиогенеза PCNA-позитив-ные ядра эндотелиальных клеток встречаются редко. На препаратах, импрегнированных по Мозеру, видно, что опухолевые клетки с конденсирующимся хроматином распределены в паренхиме как поодиночке, так и в виде небольших групп (рис. 11, в). При этом рассчитанный индекс апоптоза увеличился по сравнению с контролем более чем в 2 раза (табл. 3).

Как уже отмечалось выше, для опухолей основными факторами «потери» являются некроз и апоптоз. Механизмы некроза связывают с нарушением кровоснабжения, снижением доставки к клеткам кислорода и глюкозы, нарушением про-

174

ницаемости клеточных мембран, снижением синтеза АТФ и активацией лизосомальных ферментов. Известны несколько факторов, способных инициировать этот процесс. Так, меди-каментозно вызванная гипотензия или сосудистая окклюзия вызывают увеличение развития некроза или способствуют некротизации опухолей [57, 136]. К быстрому развитию геморрагического некроза и торможению роста опухолей приводит введение животным рекомбинантного туморонек-ротического а-фактора (ТНФ) [35, 140]. Установлено, что одной из мишеней ТНФ является эндотелий сосудистой стенки опухолей. Полагают, что этот цитокин индуцирует апоптоз опухолевых клеток, но не действует на нормальные клетки [46]. Введение серотонина оказывает более выраженное действие на сосуды новообразований по сравнению с нормальными тканями, что создает условия для формирования в опухолях глубокой гипоксии и соответственно предпосылки для развития некроза [48, 140]. Есть данные о роли серотонина в потенцировании действия ТНФ [105]. В отличие от некроза, апоптоз представляет активный процесс самоуничтожения клеток. В механизме запуска апоптоза ключевым моментом является активация эндогенной нуклеазы, расщепляющей ядерную ДНК на фрагменты. По современным представлениям, апоптозу отводится ведущее место в поддержании клеточного баланса как в физиологических условиях, так и при действии разных токсических стимулов. Есть данные, что при противоопухолевой терапии апоптоз может выступать как один из патогенетических факторов, определяющих рост или регрессию злокачественных новообразований [90, 106]. Насчитывается более 50 медиаторов, отсутствие или присутствие которых могут инициировать процесс апоптотической гибели клеток [137]. К их числу относится слабое воздействие агентов, в том числе и гипоксия, которое может приводить к некрозу.

Полученные нами результаты микроскопического исследования свидетельствуют о формировании в паренхиме опухолей животных, леченых эпиталоном, как морфологических проявлений геморрагического некроза, так и усиление апоптоза опухолевых клеток. Можно было бы попытаться объяснить увеличение апоптотической гибели опухолевых клеток за счет нарастающей гипоксии. Между тем существуют веские иммуногистохимические доказательства, что в зонах гипоксии пролиферативный потенциал опухолевых клеток снижается. Так, по данным Ралея с сотрудниками [130], им-муноокрашивание ядер клеток на PCNA в зоне локализации

175

маркера гипоксии CCI-103F проявляется слабее, либо поля гипоксии и активной пролиферации клеток не перекрываются. Количественный анализ свидетельствует об отрицательной корреляционной связи между связыванием гипоксиче-ского маркера пимонидазола и иммунолокализацией PCNA [88]. В данной работе определение пролиферативной активности и апоптотической гибели опухолевых клеток было проведено на серийных гистологических срезах. Если бы зарегистрированная нами индукция апоптоза была обусловлена только гипоксией, то и пролиферативная активность опухолевых клеток также должна была существенно снизиться. Однако полученные данные не подтверждают это предположение. Анализ литературы по этому вопросу позволяет предположить, что эпиталон может модулировать функциональную активность клеток, продуцирующих факторы инициации апоптоза.

Результаты кинетических и морфофункциональных исследований свидетельствуют о том, что пептид вилочковой железы — вилон — оказывает неоднозначное действие на рост имплантированной соединительнотканной опухоли. Проявление его эффекта зависит от вводимой дозы и стадии развития опухоли. Объективно регистрируемый эффект ин~ гибирования роста опухоли проявился лишь после введения этого препарата в достаточно малых дозах в латентном периоде формирования новообразования. Инъекции препарата в аналогичных дозах в период активной фазы роста опухоли практически не влияли на ее кинетические параметры. Увеличение разовой дозы исследуемого препарата до 5 мкг может сопровождаться как усилением, так и инвертированием ингибирующего действия. Результаты морфофункциональ-ного анализа свидетельствуют, что после пролонгированного введения вилона в больших дозах основные события развертываются в периваскулярной строме и связаны с активизацией ангиогенеза. В этих условиях поддержание клеточного баланса в опухоли будет, по-видимому, определяться соотношением усиленной пролиферации опухолевых клеток и их индуцированной гибели. Результаты количественного анализа свидетельствуют, что уровень апоптоза опухолевых клеток после инъекций вилона во всех экспериментальных группах выше, чем в контрольной группе животных. При этом обращает внимание активизация стромальных клеток микроокружения — тучных клеток, гранулоцитов и моноцитов. Не исключено, что полученный положительный эффект вилона может еще более усиливаться в условиях терапевтиче-

176

ских мероприятий, направленных на ингибирование ангиогенеза в опухолях. Вместе с тем не вызывает сомнения актуальность дальнейшего изучения вилона, как препарата, оказывающего стимулирующее действие на пролиферацию эндотелиальных клеток и ангиогенез. Последнее может найти применение для коррекции нарушенной гемодинамики, ускорения заживления вяло текущих ран и трофических расстройств.

Совокупность результатов проведенных исследований показала, что регистрируемый после введения эпиталона эффект торможения роста саркомы М-1 обусловлен развитием геморрагического некроза и усилением апоптоза опухолевых клеток. По показателям пролиферативной активности замедление роста опухолей не было связано с прямым цитостати-ческим действием этого препарата на опухолевые клетки. Морфологические признаки свидетельствуют о специфическом механизме действия, который реализуется через сосудистое русло опухолей. Полученные данные и анализ литературы по данному вопросу позволяют предположить, что регистрируемый после введения эпиталона эффект развития геморрагического некроза саркомы М-1 обусловлен комплексным действием ряда перечисленных выше факторов и реализуется через микроциркуляторное русло опухолей. По-видимому, в механизме запуска сосудистой реакции определенную роль могут играть тучные клетки и экспрессия в них серотонина. На наш взгляд, полученные данные об усилении индуцированной гибели опухолевых клеток после введения эпиталона свидетельствуют о принципиальной возможности применения этого пептида в качестве потенциального противоопухолевого препарата.