3.3. Участие пептидов

в регуляции активности хроматина и образовании свободных радикалов

Поскольку митохондриальная ДНК кодирует в основном полипептиды дыхательной цепи и не содержит информации об известных репарационных белках, на протяжении долгого времени считали, что репарация повреждений в митохондриальной ДНК невозможна. Единственной альтернативой традиционного лечения митохондриальных цитопатий являлась потенциальная возможность генетической модификации утраченных митохондриальных функций [45, 54, 55, 69]. Однако более глубокие исследования, проведенные Бохром и сотрудниками в лаборатории молекулярной геронтологии и генетики Национального института старения (Балтимор, США), показали, что в митохондриальных экстрактах могут быть обнаружены многие из известных ферментов репарации ядерной ДНК (ДНК-фосфорилаза, этилгуанинтрансфераза, метилтрансфераза, урацил-ДНК-гликозилаза, 8-оксо-гуано-зин-эндонуклеаза класса I, эндонуклеаза класса II, dRP-ми-азная активность). Для установления механизма репарации митохондриальной ДНК, плазмиду, содержащую известные Дефекты оснований, обрабатывали митохондриальными экстрактами, выделенными как из тканей крыс, так и из тканей человека. Было показано, что репарация возможна, но процесс носит комплексный характер и требует участия нескольких репарационных ферментов, экспрессируемых ядерной АНК [42, 47]. Так, для удаления 8-oxo-dG путем замены

61

основания требуется участие фермента оксигуанозин-ДНК-гликозилазы. Клетки с удаленным геном этого фермента не могут участвовать в репарации митохондриальной ДНК и к окончанию жизненного цикла содержат в 20 раз большее количество 8-oxo-dG, чем митохондриальная ДНК клеток дикого типа [46].

Вышеупомянутые факты свидетельствуют о том, что модуляция экспрессии репарационных ферментов ядерной ДНК под действием каких-либо внешних сигналов может оказывать влияние на восстановление поврежденного мито-хондриального генома и затем на образование свободных радикалов в клетке. В наших предыдущих исследованиях было показано, что короткие пептиды тимуса и эпифиза могут принимать участие в регуляции генетической активности клеток [19]. Это явилось предпосылкой для изучения влияния мелатонина, эпиталамина и синтетических пептидов ви-лона и эпиталона на свободнорадикальные процессы у человека и животных.

Как было показано ранее, уровень образования свободных радикалов и их обезвреживания неодинаков для разных органов. Наиболее интенсивное образование активных форм кислорода наблюдается в сыворотке крови, где оно более чем в 2 раза превышает соответствующие показатели в печени и мозгу. При этом уровень общей антиоксидантной активности в сыворотке крови значительно ниже, по сравнению с таковым в печени и мозгу. Введение вилона не оказало сколько-нибудь существенного влияния ни на один из изученных показателей. Введение эпиталона эффективно угнетало образование активных форм кислорода в ткани мозга. Закономерно с этим, в присутствии эпиталона, ослаблялся процесс перекисного окисления липидов. Причем в головном мозгу действие эпиталона было направлено преимущественно на конечные этапы этого процесса (основания Шиффа), а в печени — в основном на начальный этап (диеновые конъюга-ты). Введение мелатонина приводило к достоверному повышению общей антиокислительной активности в сыворотке крови мышей и угнетало оба этапа перекисного окисления липидов в печени и головном мозгу.

Как было отмечено ранее, наиболее интенсивное образование активных форм кислорода, в том числе при старении организма, наблюдается в сыворотке крови. Были проведены дополнительные исследования влияния мелатонина и комплекса пептидов эпифиза (эпиталамин) на показатели свобод-норадикальных процессов в сыворотке крови крыс [32]. Эпи-

62

таламин вводили 2—3-месячным крысам в течение 5 дней в утренние часы подкожно в дозе 0.5 мг на животное. Мелато-нин давали с питьевой водой (20 мг/л).

При введении эпиталамина существенно снижаются интенсивность перекисной хемилюминесценции в сыворотке крови (в 3.4 раза) и перекисного окисления липидов. Это выражается в значительном снижении содержания диеновых конъюгатов (в 4.1 раза), тогда как содержание шиффовых оснований имело лишь тенденцию к снижению. Уровень пе-роксидации белков сыворотки крови не претерпевал заметных изменений при воздействии эпиталамина. Мелатонин также снижал интенсивность перекисного окисления липидов — в сыворотке крови снижался уровень диеновых конъюгатов и оснований Шиффа. Следует отметить, что при введении мелатонина содержание карбонильных производных аминокислот в белках несколько увеличивалось. Введение как эпиталамина, так и мелатонина сопровождается существенным увеличением общей антиокислительной активности (на 35 %). Наши наблюдения свидетельствуют о том, что эпиталамин и мелатонин способствуют снижению выработки свободных радикалов в клетке, защищают белки и липиды от перекисного окисления и, таким образом, способствуют поддержанию структурно-функциональной целостности клетки и ее резистентности к внешним неблагоприятным воздействиям.

Следует подчеркнуть, что исследованные нами гормональные продукты эпифиза (эпиталамин и мелатонин), а также синтетические пептиды (вилон и эпиталон) обладают выраженной общей антиокислительной активностью, однако механизм их действия, вероятно, неодинаков и имеет комплексный характер. Мелатонин и пептиды эпифиза могут оказывать влияние как на функционирование ферментов антиоксидантной системы клетки, так и на выработку в ней свободных радикалов. В дальнейших экспериментах с плодовыми мушками Drosophila melanogaster мы исследовали возможное участие пептидов в регуляции выработки свободных радикалов в митохондриях на протяжении жизни организма.

Введение в питательную среду эпиталона повышает активность ферментов антиоксидантной защиты у D. melanogaster к ослабляет интенсивность перекисного окисления липидов на протяжении всей жизни имаго [35]. Нами проведено исследование влияния пептидов эпиталона и вилона на генерацию активных форм кислорода в субклеточных фракциях D. melanogaster линии НА⁺ [37]. Для этого эпиталон и

63

Рис. 1. Содержание активных форм кислорода в митохондриях и цитозоле Drosophila melanogaster линии НА⁺, измеренные методом

перекисной люминолзависимой хемилюминесценции. Светлые столбики — молодые особи (10 сут), темные столбики — зрелые (25 сут); / — контроль, 2 — вилон, 3 — эпиталон, р < 0.05; * — по сравнению с контролем, ⁺ — по сравнению с молодыми особями [37].

вилон, растворенные в физиологическом растворе, добавляли в питательную среду в количестве 0.00001 % от массы среды, которые воздействуют на личинок 2—3-го возраста. Таким образом, длительность действия не превышала 2 сут. Митохондрии выделяли из имаго 10 и 25 сут, т. е. из мух молодого и зрелого возраста. Оставшийся после отделения ми-тохондриальных и ядерных фракций суммарный препарат (цитозоль) содержал микросомы и растворимую часть клеток. Цитозоль использовали для определения количества свободных радикалов, вырабатывающихся вне митохондрий. Генерацию активных форм кислорода в организме самцов и самок определяли отдельно. Результаты исследований отражены на рис. 1.

Представленные ранее данные литературы подчеркивают важную роль митохондрий в процессе генерации свободных радикалов и изменении этого показателя на протяжении жизненного цикла организма. Действительно, полученные нами результаты убедительно показывают, что содержание активных форм кислорода в митохондриях как молодых, так

64

и взрослых особей на порядок превышает их содержание в цитозоле. Кроме того, уровень образования активных форм кислорода в митохондриях самцов во всех вариантах опытов был в среднем в 2 раза выше, чем у самок. Эти результаты согласуются с нашими данными о том, что средняя продолжительность жизни самцов этой линии составляет 22 дня, а самок — 30 дней. Возраст самок к моменту измерения был меньше средней продолжительности жизни, а возраст самцов превысил ее. Вероятно, у самцов в исследованный период времени уже началось возрастное снижение активности системы антиоксидантной защиты, что отразилось на увеличении уровня активных форм кислорода, продуцируемых митохондриями.

При исследовании влияния пептидов на процесс выработки свободных радикалов в митохондриях было показано, что достоверное снижение образования активных форм кислорода наблюдается только у самок при действии вилона. При этом уровень генерации активных форм кислорода снижался как у молодых (в 1.7 раза), так и у зрелых особей (в 1.5 раза) по сравнению с контролем. Эпиталон не оказывал существенного влияния на процессы генерации активных радикалов. Вероятно, действие вилона, а также отдельных пептидных фракций, входящих в состав комплексного препарата эпита-ламина, направлено на поддержание функционального состояния белков-переносчиков в дыхательной цепи, в то время как эпиталон в большей степени способствует увеличению активности ферментов антиоксидантной защиты клетки.

Известно, что сердце является органом, характеризующимся высоким уровнем энергообмена, сопряженным с дыханием. Клетки мышечных тканей сердца содержат большое количество митохондрий. Для установления возможного участия пептидов в регуляции функциональной активности дыхательной цепи митохондрий определяли влияние, которое оказывают вилон, тимоген и эпиталон на экспрессию генов, представленных в сердце [4]. Пептидные препараты вводили в виде подкожных инъекций здоровым взрослым мышам линии СВА. Животные контрольной группы получали подкожные инъекции физиологического раствора. Относительные уровни экспрессии генов в сердцах животных контрольной и экспериментальных групп измерялись методом гибридизации меченных радиоактивным изотопом фосфора проб кДНК, приготовленных из общей РНК сердец с микро-^аРреем в составе 15 247 клонов из комплекта, который принадлежал Национальному институту старения США.

³ Зак. №4312 65

Необходимо отметить, что протестированные пептиды — вилон, тимоген и эпиталон — способны влиять на экспрессию ядерных и митохондриальных генов, представленных в сердце здоровых взрослых мышей. Под действием пептидов изменялась экспрессия 1.25—1.74 % всех генов как в сторону увеличения (до 6.61 раза по сравнению с контролем), так и в сторону уменьшения (до 3.06 раз по сравнению с контролем). Среди генов, экспрессия которых менялась при введении в организм пептидов, отмечены группы, ответственные за клеточную структуру и подвижность; гены, кодирующие пептиды защитных систем клетки; группа генов восприятия клеточных сигнальных систем и систем коммуникации. Особую группу генов, реагирующих на воздействие исследованных пептидов, составляют гены экспрессии регуляторных белков, гены регуляции метаболизма и клеточного деления [4].

В ходе более подробного рассмотрения экспрессии мито-хондриального генома под действием исследованных пептидов и мелатонина, было выявлено, что пептиды изменяют более чем в два раза уровень таких митохондриальных генов, как 16 S, НАДН-дегидрогеназы 1, цитохром С оксидазы 1, НАДН-де-гидрогеназы 4, НАДН-дегидрогеназы 5, цитохрома В.

Механизм, посредством которого исследуемые нами пептиды воздействуют на белки-переносчики электронов дыхательной цепи митохондрий, представлен на рис. 2. До настоящего момента не установлено, есть ли непосредственное взаимодействие исследуемых пептидов с ядерной или мито-хондриальной ДНК. Вероятнее всего пептиды эпифиза (синтетические и природные), как и большинство пептидных гормонов и других внешних сигналов нелипофильной природы, реализуют свое регуляторное действие через универсальный для эукариот мембранно-внутриклеточный механизм. Такой механизм регуляции обмена веществ характерен для веществ, не проникающих через клеточную мембрану, и опосредован действием вторичных медиаторов (мессенджеров) — циклических нуклеотидов цАМФ, цГМФ, ионов Са²⁺, а также церамида и фосфорилхолина. Известно, например, что действие таких тканевых регуляторов деления клетки, как кей-лоны и интерферон, опосредовано действием цАМФ, в то время как действие фитогемагглютининов и факторов роста нервов — цГМФ и Са²⁺ [13, 24]. Установлено, что в процессе передачи внешнего сигнала от пептидов вилона, тимогена и эпиталона к ядерной ДНК задействованы по крайней мере три клеточные системы вторичных мессенджеров: аденилат-, (гуанилат-) циклазная (тимоген) и сфингомиелиновая (ви-

66

лон, эпиталон) [14, 20]. В данной регуляторной системе пептиды (как нестероидные гормоны или любые другие внеклеточные регуляторы) связываются с рецепторами на поверхности клетки и активируют аденилат,-(гуанилат)-циклазу или нейтральную сфингомиелазу. Образовавшиеся при этом вторичные мессенджеры осуществляют свое действие через соответствующие протеинкиназы (ферменты, катализирующие реакции фосфорилирования), а протеинкиназы на последующих этапах регулируют уровень фосфорилирования гистонов, негистоновых белков хроматина (НГБ) [68] или активируют другие системы модификации ядерных белков, в том числе метилирование и ацетилирование гистонов [7, 39]. Далее, в результате физико-химических изменений, возникающих либо в гистоновом октамере, либо в молекуле ДНК, происходит ослабление силы взаимодействия между ДНК и гистонами и разворачивание минимальной нуклеосомы (структурной единицы хроматина). ДНК, свободная от гистонов, становится доступной для считывания информации ферментами транскрипции [68]. Происходит белковый синтез. Таким образом, регулируется матричная активность хроматина.

По всей видимости на первых этапах регуляции активности хроматина исследуемые нами пептиды продуцируют выработку других регуляторных ядерных белков и пептидов. Так, при действии вилона и эпиталона в клетках сердца наблюдали усиление экспрессии многих известных регуляторных негистоновых белков хроматина (убиквитина, убиквити-ноподобного белка SUMO-1, Box-белков, белков цинкового пальца ZNF01, HUMORFKG1B, Zfp61) и связанных с их функционированием систем (убиквитин-коньюгирующий фермент системы убиквитинзависимого протеолиза, протеи-назы, пары циклин-циклинзависимых киназ) [4]. Перечисленные негистоновые белки хроматина осуществляют контроль клеточного цикла и стимулируют синтез белков в ответ на внешние воздействия, в том числе белков и ферментов, участвующих в репарации ДНК. Известно, что транскрипци-онно-активный хроматин содержит повышенное количество Убиквитина, ковалентносвязанного с гистоном Н2А [8]. Убиквитин отщепляется от гистонов во время митоза и коньюгирует снова при репликации хроматина. Кроме того, Убиквитин обеспечивает быстрое расщепление связанных с ним белков на протеосомах (убиквитинзависимый протео-лиз). Эта протеолитическая система является частью механизма регуляции клеточного цикла посредством активации

67

убиквитинзависимого протеолиза многих факторов активации транскрипции, таких как циклины и транскрипционный фактор Мус. Недавно обнаружено, что есть взаимосвязь между убиквитинзависимым протеолизом и процессами мутагенеза и репарации ДНК. В частности, убиквитин-коньюги-рующий ферментный комплекс принимает участие в по-стрепликационной репарации ДНК и обеспечивает защиту ДНК от внешних повреждений в различных денатурирующих условиях [67]. В отличие от убиквитина группа убиквити-ноподобных белков, к которым относится SUMO-1, регулирует переход клеток из G2 в фазу митоза посредством контроля размера теломеров и процесса сегрегации хромосом [66].

Хорошо известно, что функционирование митохондрий и репарация митохондриальной ДНК невозможны без импорта белков, кодируемых ядерным геномом [11]. Ферменты репарации ядерной ДНК синтезируются в цитоплазме и с помощью белков-переносчиков митохондриальной мембраны транспортируются в матрикс митохондрий. Вероятно, так регулируется репаративная и транскрипционная активность митохондриальных генов под действием таких исследованных пептидов, как вилон, тимоген и эпиталон.

Усиление общей экспрессии митохондриальных генов имеет очень большое значение для стареющего организма, так как большинство митохондриальных дисфункций сопряжены с заниженным уровнем транскрипции митохондриальной ДНК, недостаточным белковым синтезом и ослабленным митохондриальным дыханием (продукцией энергии) [52]. Кроме того, в основе большинства возрастных митохондриальных болезней лежат мутации в одном или двух генах митохондриальной ДНК, которые кодируют субъединицы дыхательной цепи. В этом случае репарация дефектов генов и восстановление функций мембранных белков уменьшают риск возникновения и развития митохондриальных цитопатий. Исследованные пептиды (вилон, тимоген и эпиталон) усиливают экспрессию генов дыхательной цепи митохондрий и особенно субъединиц ND4 и ND5 НАДН-де-гидрогеназы, что является перспективным для терапии ней-родегенаративных старческих заболеваний, связанных с мутациями в этих генах [60, 65], в том числе острой энцефалопатии, лейкодистрофии, миоклональной эпилепсии, болезни Паркинсона и болезни Альцгеймера [12, 58].

Резюмируя представленный обзор данных, следует подчеркнуть, что процессы свободнорадикального окисления

играют существенную роль в механизмах старения и развитии возрастной патологии. Применение пептидов для восстановления нарушений пептидергической регуляции го-меостаза имеет важное значение при лечении и профилактике возрастной патологии.