Подготовка сред к стерилизации.

При автоклавировании 3 — 5 % жидкости теряется в ре­зультате испарения, поэтому рекомендуется в приготавливаемые среды добавлять сверх объе­ма примерно 5 % дистиллированной воды. Тог­да после стерилизации среда (раствор) будет иметь требуемую концентрацию.

Среды обычно стерилизуют в пробирках, колбах, бутылях. Емкости заполняют средой не более чем на половину их высоты, чтобы пре­дотвратить смачивание пробок. Сосуды со сре­дами закрывают ватными пробками. Они предо­храняют среду от заражения микроорганизма­ми, находящимися в окружающем воздухе.

Пробки должны быть достаточно плотными, чтобы выполнять эту функцию, но с достаточно равномерным распределением волокон ваты, так как через них происходит газообмен культур с окружающей средой. Слишком плотные пробки затрудняют снабжение культур воздухом.

Для приготовления пробки плоский кусок ваты, взятый вдоль волокна, скаты­вают валиком. Чтобы придать пробке прочность, ее прокатывают между ладо­нью и чистым стеклом, лежащим на столе. Длина пробки для обычной пробир­ки примерно 4 см. Пробка должна входить в пробирку на 1,5 — 2,0 см (рис. 4.2). Для сохранения формы пробку вынимают из горлышка, слегка вращая. Удобно обернуть пробку чистой марлевой салфеткой.

Перед стерилизацией пробки можно прикрыть бумажными колпачками. Нельзя обертывать пробки сосудов, которые будут стерилизоваться в автокла­ве, целлофаном, фольгой или другими материалами, не пропускающими пар, так как пар должен проникать через пробку в сосуд, иначе среды не нагреются до нужной температуры и не простерилизуются. При использовании стеклян­ных, резиновых, корковых и других пробок их завертывают в двойной слой оберточной бумаги и стерилизуют привязанными к склянке, закрытой ватной пробкой. Пробки в сосуде меняют стерильно около пламени горелки.

Выбор режима автоклавирования.

В микробиологической практике стерили­зацию в автоклавах осуществляют при температуре 111 — 138 °С, т.е. от 0,5 до 2,5 ати. Температура ниже 111 °С не может считаться надежной; температура выше 138°С, как правило, не является необходимой, к тому же чем выше давление пара, тем сложнее условия эксплуатации автоклава. При использова­нии автоклавов без вакуумных насосов наиболее надежными считают следую­щие режимы стерилизации: 15 — 45 мин при 121 °С (1 ати) и 10 — 30 мин при 128 °С (1,5 ати). Микробиологи чаще всего стерилизуют среды при 0,5 и 1 ати. Температура и длительность автоклавирования питательных сред определяются прежде всего их составом, термоустойчивостью или термолабильностью компо­нентов. Такие легко разрушающиеся субстраты, как молоко или желатиновые среды, а также субстраты, содержащие сахара, витамины (пивное сусло, соки, дрож­жевой автолизат и др.), обычно стерилизуют при 0,5 ати в течение 15 — 30 мин. Мясопептонные среды можно стерилизовать при 1 ати 20 мин. Среды, содер­жащие агар, стерилизуются труднее, потому что стерилизация начинается фак­тически после того, как агар расплавится. Но и расплавленный агар требует для стерилизации в два раза больше времени, чем тот же объем воды. С трудом поддаются стерилизации в автоклаве различные порошки (тальк, мел) и вязкие жидкости (глицерин, вазелиновое масло), поскольку они плохо передают тепло и очень медленно прогреваются. Их лучше стерилизовать в сушильных шкафах при 160 °С в течение 2 ч или 1 ч при 170 °С. Слой масла или порошка в сосуде не должен превышать 1,5 см.

Имеются субстраты, в которых могут быть споры, отличающиеся особой термостабилъностью. К ним относится почва, причем она, кроме того, нагре­вается с замедленной скоростью. Ее обычно стерилизуют при 1 ати либо один раз 2 ч, либо два дня подряд по 1 ч, а иногда 2 ч при 2 ати.

Выбирая режим стерилизации, необходимо учитывать рН среды. При кис­лой реакции многие вещества, входящие в ее состав, могут подвергнуться гид­ролизу. Чем ниже значение рН, чем выше температура и продолжительнее время стерилизации, тем интенсивнее происходит гидролиз. В результате после стерилизации перестают застывать среды с желатиной и даже с агаром. Если реакция среды щелочная, то при стерилизации выпадают в осадок соли желе­за; они карамелизуются и сахара становятся непригодными для использования бактериями. В некоторых случаях в процессе стерилизации изменяется рН сре­ды. Так, если рН среды с углеводами выше 7,0, то может произойти ее подкисление до рН 6,0. Чтобы избежать таких явлений, рекомендуется углеводы, фос­фаты, соли железа автоклавировать отдельно в виде более или менее концен­трированных растворов в дистиллированной воде при том значении рН, кото­рое обеспечивает целостность вещества. После стерилизации растворы объеди­няют в нужном соотношении. Таким приемом раздельной стерилизации в мик­робиологии пользуются довольно часто, поскольку многие компоненты сред нельзя стерилизовать одним и тем же способом.

Режим автоклавирования в значительной степени зависит от объема стери­лизуемого субстрата. Чем больше объем, тем больше времени при одной и той же температуре (давлении) требуется для обеспечения надежности стерилиза­ции. Имеет значение толщина стенок и форма емкостей (табл. 4.2). Это нужно учитывать в практической работе.

Например, не следует стерилизовать термочувствительный субстрат одно­временно в пробирках и больших бутылях. Если среда стерилизуется по режи­мам, рекомендуемым для малых объемов, содержимое бутыли может не про-стерилизоваться. Если же стерилизация проводится с расчетом на большой объем, среда в пробирке прогревается намного дольше и может испортиться.

После автоклавирования среды для проверки стерильности выдерживают — 3 сут в термостате при 30 °С. Если в средах обнаруживается рост микроорга­низмов, их готовят заново.