6.3. Кофакторы

Активность ряда ферментов зависит только от структуры самого белка, для других - требуется присутствие определенных групп небелковой природы, так называемых кофакторов. Могут быть металлы или сложные органические соединения, называемые коферментами; иногда требуется наличие и тех и других. Кофакторы как правило термостабильны, большинство коферментов при нагревании инактивируются. Связывание кофактора и фермента - различная степень сродства, иногда можно разделить диализом, иногда связаны ковалентно. Природный комплекс фермента с кофактором - голофермент, неактивный фермент после удаления кофактора - апофермент. Коферменты, очень прочно связанные с белком фермента, обычно называют простетической группой фермента. Однако в большинстве случаев кофермент связан с белком очень слабо и ведет себя в какой-то мере подобно субстрату. Многие важнейшие коферменты не могут синтезироваться организмом и должны поступать с пищей, то есть являются витаминами (рибофлавин, тиамин, пантотеновая к-та, никотинамид).

Витамин	Активная форма	Реакции
А (ретинол)	Ретиналь	Зрительный процесс
РР (никотиновая кислота)	НАД+, НАДФ+	Оксидоредуктазы: дыхание, перенос водорода
В1 (тиамин)	Тиаминпирофосфат	Декарбоксилирование α-кетокислот, перенос активного альдегида (транскетолазы)
В2 (рибофлавин)	ФАД, ФМН	Оксидоредуктазы: дыхание, перенос водорода
В3 (пантотеновая кислота)	КоА	Перенос ацильных групп
В6 (пиридоксин, пиродоксаль, пиридоксамин)	Пиридоксальфосфат	Аминотрансферазы и декарбоксилазы
В12 (кобаламин)	дезоксиаденозилкобаламин	Перенос алкильных групп
D (кальциферолы)	1,25-диоксикальциферол	Обмен кальция и фосфора
Н (биотин)	Биотин	Карбоксилазы (перенос СО2)
К (филлохинон)	-	Перенос электронов (кофактор в реакциях декарбоксилирования)
С (аскорбиновая кислота)	Аскорбиновая кислота	оксидоредуктазы
ВС (фолиевая кислота)	Тетрагидрофолат	Переносчик одноуглеродных фрагментов
	Гем	Перенос электронов
	КоQ	Перенос электронов

6.4. Кинетика ферментативных реакций

Вспомним терминологию и основные соотношения.

По числу вступающих в реакцию молекул различают мономолекулярные, бимолекулярные и тримолекулярные реакции.

Химические реакции можно также классифицировать на основе кинетических характеристик. Различают реакции нулевого, первого, второго или третьего порядков в зависимости от того, как при данных условиях скорость реакции зависит от концентрации реагирующих веществ.

К реакциям первого порядка относят такие, в которых скорость пропорциональна концентрации одного вещества. Простейший пример: А → Р, тогда: -d[A]/dt=k[A], .k носит название константы скорости реакции. В случае реакции первого порядка - размерность 1/с. Часто удобно использовать интегральную форму уравнения:

lg[A₀]/[A]=kt/2,303

отсюда легко получить t_1/2=0,693/k, где t_1/2 - полупериод реакции первого порядка. Заметим, что не зависит от исходной концентрации.

К реакциям второго порядка - зависит от концентраций 2 реагирующих веществ или второй степени одного вещества. Если А+В = Р, то -d[A]/dt=k[A][B], если 2А = Р, то-d[A]/dt=k[A]². Размерность константы - 1/М*с. Интегральная форма:

2,303 [B₀][A]

t = ————— * lg————

k*([A₀]-[B₀]) [A₀][B]

Важно: реакция А+В = Р не всегда реально протекает по уравнению второго порядка. Так, если концентрация А очень высока по сравнению с В, то по отношению к В это может быть реакция первого порядка. Таким образом, порядок определяется условиями протекания и не всегда отражает ее истинный механизм.

Реакции третьего порядка встречаются редко. Известны реакции, скорость которых вообще не зависит от концентраций субстратов - реакции нулевого порядка. Во многих катализируемых реакциях порядок оказывается нулевым - скорость зависит от концентрации катализатора или от какого либо другого фактора, но не от концентрации субстрата. Скорость реакции не обязательно должны в точности соответствовать первому или второму порядку - при определенных обстоятельствах могут быть реакции смешанного порядка.

Химическая реакция протекает тогда, когда некоторая доля молекул А в данный момент обладает большой энергией, чем остальная часть молекул, и этой энергии оказывается достаточно для перехода в активированное состояние, в котором появляется возможность разрыва или образования новой химической связи, ведущего к образованию продукта. Энергия активации - количество энергии в калориях, которое необходимо для перевода при данной температуре всех молекул одного моля вещества в активированное состояние.

Во всякой реакции существует переходное состояние, которое характеризуется высокой свободной энергией и определяется как состояние взаимодействующих молекул, соответствующее вершине активационного барьера. Скорость реакции пропорциональна концентрации молекул в переходном состоянии. Повышение температуры - увеличение энергии теплового движения - увеличение числа молекул, способных достичь переходного состояния. Во многих реакциях - на 10⁰С - в 2 раза.

Катализаторы ускоряют реакцию, понижая свободную энергию активации. Связывание субстрата с катализатором приводит к появлению нового переходного состояния, характеризующегося меньшей энергией активации. Образование продукта сопровождается регенерацией свободного катализатора.

Изложенные принципы кинетики химических реакций приложимы к ферментативным. Однако особенность: явление насыщения субстратом. При низких концентрациях - пропорционально концентрации (первый порядок). Затем пропорциональность нарушается (смешанный порядок). Наконец при высоких - скорость постоянна, не зависит от концентрации субстрата (нулевой порядок). Происходит как бы насыщение фермента. Эффект насыщения характерен для всех ферментов, однако концентрации субстрата, при которых происходит насыщение - существенно отличаются.

На основании изучения эффекта насыщения в 1913 Л.Михаэлис и М.Менотон - общая теория действия ферментов и ферментативной кинетики. Расширена в основном Дж.Бригсом и Дж.Холдейном.

Фермент Е сначала реагирует с субстратом S, в результате чего образуется фермент-субстратный комплекс ES, который затем распадается на свободный фермент и продукт (продукты) Р. Считается, что обе реакции обратимы; к₁, к₂, к₃, к₄ - константы скорости двух прямых (нечет) и двух обратных реакций.

k₁

Е+S ↔ ES (1)

k₂

k₃

ES ↔ E+P (2)

k₄

Заметим, существование фермент-субстратных комплексов укладывается во все имеющиеся данные о динамике ферментативных процессов. Однако прямое доказательство их существования очень затруднительно. Все же такие доказательства были получены. В ряде немногочисленных реакций комплексы весьма устойчивы (образуется ковалентная связь) и относительно долгоживущи. Кроме того, в ряде случаев (гемосодержащие ферменты) образование ферментов может быть обнаружено спектрофотометрически.

При разработке теории Михаэлис и Ментон использовали следующие допущения:

1. В процессе реакции образуется фермент-субстратный комплекс.

2. Обратной реакцией Е + Р → ЕS можно пренебречь.

3. Концентрация субстрата много больше концентрации фермента.

4. [ES] = const (рассматриваются стационарные условия).

При дальнейшем анализе - [E] - общая концентрация (как в свободной, так и в связанной форме). Поскольку концентрация субстрата обычно значительно превышает концентрацию фермента [ES] << [S]. Скорость образования ES из Е и Р очень мала, ею можно пренебречь, поэтому скорость образования фермент-субстратного комплекса составляет:.

d[ES]/dt=k₁([E]-[ES])[S] (3)

Скорость распада комплекса равна:

-d[ES]/dt=k₂[ES]+k₃[ES] (4)

При стационарном процессе:

k₁([E]-[ES])[S]= k₂[ES]+k₃[ES] или (5)

[S]([E]-[ES])/[ES]=(k₂+k₃)/k₁=K_m (6)

Объединенная константа - константа Михаэлиса. K_m характеризует активность данного фермента по отношению к тому или иному субстрату при определенных значениях температуры и рН. Из уравнения (6) легко получить выражение для фермент-субстратного комплекса в стационарном состоянии:

[S]([E]-[ES]) = K_m*[ES]

[S]*[E] = K_m*[ES] + [S]*[ES]

[ES]=[E][S]/(K_m+[S]) (7)

Поскольку начальная скорость v ферментативной реакции пропорциональна концентрации комплекса ES:

v=k₃[ES] (8)

С ростом концентрации субстрата среднее время, необходимое для эффективной встречи с ферментом снижается, тогда как время внутримолекулярного превращения комплекса в фермент и продукт остается неизменным. При очень высокой концентрации субстрата практически весь фермент находится в форме комплекса с субстратом, скорость реакции достигает максимального значения, равного

V_max=k₃[E] (9)

В (8) подставим [ES] из (7)

v=k₃[E][S]/( K_m+[S]) (10)

разделим на (9)

v/V_max ={k₃[E][S]/( K_m+[S])}/ k₃[E] (11)

Решая это уравнение относительно v:

v = V_max[S]/( K_m+[S]) (12)

Это и есть уравнение Михаэлиса-Ментен, выражающее соотношение между скоростью ферментативной реакции и концентрацией субстрата при условии, если обе константы V_max и K_m известны.

В частном случае, когда v=0,5V_max

V_max/2=[S]/(K_m+[S])

Разделив обе части уравнения на V_max, получаем 1/2=[S]/( K_m+[S]), после преобразования:

K_m+[S] = 2[S] или K_m= [S]

K_m равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину от максимальной, размерность моль/л. Не зависит от концентрации фермента - можно определить графически из кривой зависимости скорости реакции от концентрации субстрата.

K_m не имеет строго фиксированного значения - может меняться в зависимости от структуры субстрата, от рН и от температуры. У ферментов, имеющих несколько субстратов - каждый характеризуется своим значением К_м (например, выделенная из мозга гексокиназа характеризуется К_м по отношению к АТФ – 0,4, D-глюкозе – 0,05, D-фруктозе – 1,5).

K_m является экспериментально определяемой величиной, которая в идеализированном случае равна

K_m=(к₂+к₃)/к₁ (6)

Однако во многих ферментативных реакциях к₂и к₁ могут значительно превышать к₃. (В таких реакциях наиболее медленной стадией является ES → P). В таком случае:

K_m=к₂/к₁

При этих условиях K_m очевидно является константой диссоциации комплекса ES и ее можно заменить константой К_s.

К_s=[E][S]/[ES]. Но лишь в этом частном случае.

УММ - отправная точка при любом количественном описании действия ферментов. Может быть получен целый ряд полезных соотношений. Однако - кинетическое поведение большинства ферментов значительно сложнее, чем это вытекает из идеализированной схемы, лежащих в основе теории ММ. В большинстве ферментативных реакций образуется по меньшей мере 2 или 3 фермент-субстратных комплекса, возникающих в определенной последовательности:

E+S ↔ ES ↔ EZ ↔ EP ↔ E+P

EZ - комплекс, соответствующий истинному переходному состоянию.

В большинстве ферментативных реакций участвует 2 или более субстратов и образуется 2 или более продуктов. В реакции с 2 субстратами может образовываться три фермент-субстратных комплекса (ES₁, ES₂ и ES₁S₂). Два продукта - еще 3 дополнительных комплекса. В таких реакциях имеется много промежуточных стадий, каждая из которых характеризуется своей константой скорости. Кинетический анализ - исключительно сложен. Однако отправная точка во всех случаях - УММ.

Часто несложные преобразования для более удобного графического представления. Одно из наиболее распространенных - приравниваются обратные величины (у-е Лайнуивера-Бэрка):

1/v=( K_m+[S])/ V_max[S]= K_m/ V_max[S]+[S]/ V_max[S]= K_m/ V_max[S]+1/V_max (13)

График, построенный в координатах 1/v и 1/[S], представляет собой прямую, тангенс угла наклона = K_m/V_max, отрезок, отсекаемый на оси ординат=1/V_max. Позволяет более точно определить V_max (на исходной зависимости - асимптотическая величина).

УММ применяют не только для определения скорости от субстрата. В тех случаях, когда активность проявляется только в присутствии кофактора, можно применять для зависимости скорости от концентрации кофактора. Считается, что существует равновесие:

Е+Ко ↔ Еко.

ЕКо затем может связывать субстрат, что приводит к образованию тройного комплекса:

ЕКо+S ↔ ЕКоS,

концентрация которого определяет скорость ферментативной реакции. Очевидно, могут быть два насыщения фермента - субстратом и кофактором. Абсолютно аналогичные выкладки - если в первом случае К_м -концентрация субстрата при половинной скорости, то во втором - концентрация кофермента, при которой активность составляет половину максимальной. При определении К_м для кофактора концентрацию субстрата поддерживают постоянной на уровне насыщения и измеряют скорость при различных концентрациях кофактора. Во многих реакциях кофермент формально ведет себя как субстрат - справедлив тот же формализм.