Методы оценки специфической и неспецифической резистентности

Специфическая резистентность – это невосприимчивость организма (популяции) к возбудителям инфекционных и паразитарных болезней или токсинов. Устойчивость животных к неблагоприятным факторам внешней среды, в том числе и к возбудителям инфекционных болезней, обусловлена комплексом неспецифических и специфических факторов. В основе специфической резистентности лежит иммунная реактивность, т.е. ответная реакция организма на действие специфических агентов. Иммунная реактивность обеспечивается функцией иммунной системы.

Оценка иммунного статуса

Оценка иммунного статуса организма включает в себя а) — сбор и анализ информации о частоте и характере течения инфекционных заболеваний, наличии хронической инфекции, признаках аллергизации, б) — выявление бактерио- или вирусоносительства с помощью бактериологических, вирусологических и серологических исследований; в) — проведение лабораторных исследований крови с использованием иммунологических тестов 1-го и 2-го уровней. При этом исследуют не менее 10% особей от численности стада (популяции).

К тестам 1-го уровня относится определение количества лейкоцитов, нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов, процентного содержания и абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов, уровня иммуноглобулинов крови, оценка показателей неспецифической защиты организма (фагоцитарная активность нейтрофилов, система комплемента, лизоцим). Тесты 1-го уровня позволяют выявить грубые нарушения со стороны иммунной системы.

Тесты 2-го уровня позволяют провести более тщательный анализ для уточнения характера дефекта, выявленного на предыдущем этапе с помощью ориентировочных тестов. К ним относится определение субпопуляций Т-лимфоцитов (CD4⁺ и CD8⁺), их соотношений, оценка их функциональной активности, супрессорного потенциала, анализ цитокинов и их рецепторов. Функциональная активность лимфоцитов может быть оценена по количеству бластных форм, нарастающих после активации клеток. Потенциальную способность лимфоцитов к активации оценивают после стимуляции митогенами (фитогемагглютином и др.) культивируемых вне организма клеток. Количество бластных форм может быть определено при микроскопии. Более точен и чувствителен радиометрический метод, оценивающий интенсивность включения радиоактивных предшественников (тимидина) в ДНК культивируемых клеток. Для оценки иммунной защиты слизистых используется определение секреторных иммуноглобулинов IgA.

Определение количества лейкоцитов

Количество лейкоцитов подсчитывают при помощи автоматического счетчика или в камере Горяева. Для подсчета лейкоцитов в камере готовят жидкость Тюрка — раствор уксусной кислоты, подкрашенный водным раствором метиленового синего (на 9 мл 10% уксусной кислоты добавляют 0,1 мл 0,1% раствора метиленового синего). В пробирку наливают 0,4 мл жидкости Тюрка. Набирают точно 0,02 мл крови, осторожно добавляют к разводящей жидкости. Разведение крови составляет 1:20. Смесь хорошо перемешивают и оставляют на 4 мин. Заполняют камеру Горяева, предварительно тщательно встряхнув пробирку с разведенной кровью. Камеру оставляют на 1 мин на ровной поверхности для оседания лейкоцитов. Затем подсчитывают лейкоциты при малом увеличении микроскопа (объектив 8, окуляр 10 или 15) при затемненном поле зрения (при опущенном конденсоре или суженной диафрагме). Лейкоциты считают в 100 неразграфленных больших квадратах, что соответствует 1600 малым. Результаты подсчета клеток в больших квадратах суммируют и производят вычисление их количества в 1 мкл крови по формуле:

г де X — количество лейкоцитов в 1 мкл крови; А — количество клеток, сосчитанных в 100 больших квадратах;1600 — количество малых квадратов; 20 — разведение крови; 4000 — множитель,приводящий результат к объему 1 мкл крови, исходя из объема малого квадрата (1/4000 мкл).

Подсчет лейкоцитарной формулы. Исследуют окрашенные мазки периферической крови. Необходимым условием для правильного учета морфологических особенностей кровяных клеток является правильно сделанный и хорошо окрашенный мазок крови. Мазок крови готовят на сухих, чистых, хорошо обезжиренных предметных стеклах, выдержанных в смеси Никифорова (этиловый спирт 96º и диэтиловый эфир 1:1). Взяв предметное стекло за длинные края, прикасаются его поверхностью к капле крови (но не к коже), выпущенной из прокола, либо наносят каплю крови микропипеткой или капилляром. Предметное стекло держат на столе или в левой руке за узкие края. Правой рукой приставляют шлифованное стекло узким краем к стеклу с кровью слева от капли под углом 45° и продвигают его вправо до соприкосновения с кровью. Выжидают, пока кровь расплывется по всему ребру шлифованного стекла, и затем легким быстрым движением ведут его справа налево до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. Капля крови должна быть небольшой и соразмерена так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1-1,5 см до его края. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается «метелочкой». Высохшие на воздухе мазки крови, опускают в специальную посуду для фиксации или в обыкновенные стеклянные стаканы, наполненные фиксирующей жидкостью (метиловый спирт, время фиксации 3-5 мин; этиловый спирт, 30 мин; смесь Никифорова, 20-30 мин). Зафиксированные препараты сушат на воздухе, после чего окрашивают красителем Романовского-Гимзы. Готовый раствор краски Романовского-Гимза (азурэозин) разводят 1:10 в необходимом для окрашивания объеме. Фиксированные мазки заливают разведенной краской, которую наливают на мазок возможно более высоким слоем. Окрашивание длится в зависимости от температуры воздуха в помещении от 25 до 45 мин. После окончания окраски краску смывают дистиллированной водой и ставят мазки вертикально в деревянный штатив для просушивания. Микроскопию мазков крови проводят с иммерсией при увеличении 100×10. Подсчет лейкоцитов ведут по зигзагообразной линии («линии Меандра»), Подсчитывают 100-200 клеток, учитывая количество отдельных форм лейкоцитов: палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты, лимфоциты. Вычисляют процент каждого типа клеток.

Подсчет абсолютного числа фагоцитов и лимфоцитов. Абсолютное число фагоцитов (нейтрофилов и моноцитов) и лимфоцитов высших позвоночных вычисляют на основании данных о количестве лейкоцитов в периферической крови и лейкоцитарной формулы.