4. Окрашивание препарата

При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержателъ. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окрашивания меняет­ся от 1 до 5 мин. По окончании окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.

Существуют простые и дифференцированные методы окраски. При простой окраске используют какой-либо один краситель, например, метиленовый синий, фуксин, генциан фиолетовый в щелочных или карболовых растворах. Прокрашивается вся клетка. При дифференцированной окраске отдельные структуры клетки окрашиваются разными красителями. Таковы методы окраски по Граму, окраска спор.

Для окрашивания микроорганизмов применяют кислые и основные красители. Первые вступают в реакцию с веществами основной, вторые – кислотной природы. Поскольку в белках есть основные (-NH₂) и кис­лотные (-СООН) радикалы, клеточные структуры хорошо окрашиваются теми и другими красителями.

Из основных красителей наиболее час­то в микробиологии применяют красные - нейтральный красный, сафранин, фуксин; синие - метиленовый синий; фиолетовые - генциан фиолетовый, метиленовый фиолетовый; зеленые - метиленовый зеленый, малахитовый зеленый и другие. Кислые красители могут быть следующие: красные и розовые - кислый фуксин, эритрозин; желтые - конго, флуоресцеин.

Красители можно разделить на позитивные и негативные. Позитивные красители окрашивают клетки (при комнатной температуре в тече­ние 30 – 60 с); негативные –пространство, окружающее микроорганиз­мы. В результате клетки выглядят силуэтами на фоне красителя.

Окраска клеток микроорганизмов го граму

Этот метод дифференциация микробных клеток основан на различии в химическом составе клеточных оболочек. Сущность его в том, что в клетках одних видов (стафилококков, стрептококков) образуется не­растворимое в спирте соединение йода с основным красителем, у дру­гих видов (возбудители кишечных заболеваний) это соединение появля­ется временно и после обработки спиртом растворяется. Микробов первой группы называют грамположительными, второй - грамотрицательными. Отношение к окрашивание по Граму имеет большое диагностическое значение.

Техника окраски по Граму.

На предметное стекло наносят два тонких мазка культуры микроорга­низмов. Мазки высушивают, фиксируют и окрашивают в течение 1 мин. феноловым раствором кристаллического фиолетового, дерна стекло в несколько наклонном положении. Сливают краситель и, не промывая препарат водой, наносят на него раствор Люголя на I мин (до полно­го почернения мазка). Стекло и в этом случае лучше держать в нак­лонном положении. Препарат, не промывая водой, обрабатывают, непрерывно покачивая 96% этиловым спиртом в течение 15 - 20 с. Бремя обесцвечивания очень существенно, пря превышении указанного срока обесцвечивается и грамположительные клетки, при недостаточном сро­ке обработки препарат оказывается перекрашенным. Промыв водой пре­парат окрашивают фуксином Пфейфера в течении 1 мин. После этой об­работки грамположительные микроорганизма окрашиваются а темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные получают только дополнительную; ок­раску (фуксина) в приобретают ярко-малиновый цвет.

Результат окраски по Граму зависят от возраста культуре: в старых мертвые клетки всегда окрашиваются грамотрицательно.

3 настоящее время более широкое применение в практике находит видоизмененные способ окраски Грама по Синеву. Основной краситель в виде раствора заменяют фильтровальной бумагой, пропитанной 1% спиртовым раствором кристаллического фиолетового. На препарат помещают фильтровальную бумажку и наносят на нее 2-3 капля вода. Окра­шивание идет в течение 1-2 мин. Затем бумажки снимают и дальней­шую окраску препарата ведут общепринятым способом.