8.5. Генно-інженерні підходи до вирішення проблеми засвоєння азоту

Азот – один із найнеобхідніших елементів для рослин. Його нестача в ґрунті чи поживному субстраті часто призводить до гибелі рослини, тому в першу чергу необхідно внести в грунт азотні добрива. Однак їх виробництво потребує великих енергетичних затрат, тому воно дороге. Вартість азотних добрив у 6 разів вища вартості фосфорних та в 16 разів вища вартості калійних добрив. При цьому рослини використовують від 30 до 70% внесених у грунт доступних форм азоту, все інше просто вимивається з ґрунту, забруднюючи навколишнє середовище. Більш природне та доступне збагачення рослин азотом шляхом його біологічної фіксації.

Фіксація атмосферного азоту (діазотрофність) – властивість прокариотичних організмів. Азотфіксуючі організми поділяються на симбіотичні (90%) та вільно існуючі (10%). Фіксація атмосферного азоту пов’язана переважно з симбіотичними мікроорганізмами. В даний час відомі чотири основні системи симбіозу, які мають велике значення не тільки для природних співтовариств, а й для сільського господарства, лісоводства. Це Rhizobia – бобові рослини, Azolla-Anabaena – рис, Actinomyces – дерева, Spirillum – трави. Атмосферний азот фіксується завдяки унікальному ферменту – нітрогеназі.

У 1960 році американські дослідники показали, що нітрогеназа зберігає свою активність без клітинних екстрактів Clostridium pasteurianum. Це послужило поштовхом для початку активних досліджень біохімії азотфіксації, структури й механізму дії нітрогенази. До 1981 року нітрогеназа була виділена із 36 видів мікроорганізмів. Вона вважається одним із найбільш складних ферментів, які використовують прості субстрати. Крім азоту нітрогеназа може відновлювати ацетилен, ціаністий водень, окиси азоту та інші з’єднання. Відновлення ацетилену в етилен дозволило розробити надійний тест для виявлення азотфіксуючої активності. Неодмінні умови роботи нітрогенази – її захист від кисню, який інгібує не тільки активність нітрогенази , але й її біосинтез.

Починаючи з 1970 року, стали з’являтися серйозні роботи по вивченню генів азотфіксації та їх переносу в клітини Klebsiella pneumoniae та E. coli. За допомогою техніки рекомбінантних ДНК були складені генетичні карти генів азотфіксації (nif-генів), які показали схожу організацію генів у більшої частини азотфіксуючих організмів. Було встановлено, що nif-гени розташовані між генами, що кодують біосинтез гестидину (his) та генами, відповідальними за засвоєння шикимівої кислоти (shiA). Гени, кодуючи синтез білкових субодиниць компонентів нітрогенази утворюють єдиний оперун (рис. 24). В клітинах симбіотичних бактерій Rhizobiuv leguminosarum, R. meliloti, R.trifolii плазміди, окрім структурних генів нітрогенази, складають гени, які відповідають за розвиток кореневих бульб в деяких видах бобових.

пар нуклеотидів

Рис.2 Генетична карта області nif-генів хромосоми Klebsiella pneumoniae (по Сассон, 1987). Оперон HDKY кодує білки нітрогенази; стрілочки вказують напрям транскрипції

Конструювання плазмид, які несуть nif-гени, дозволяє передавати здатність до фіксації азоту організмам, які не володіють цими властивостями. Серед бактерій, окрім E. coli, такий переніс здійснений для бактерій Salmonella typhimurium, Erwinia herbicola та інших. Однак подібні маніпуляції можуть призводити до небажаних ефектів. Так, переніс генів у штам Erwinia (бактерії, що викликають гниття рослин) може посилити його патогенну дію. Крім того, існує ймовірність випадкового переносу разом з nif-генами якихось небажаних генів.

В даний час увагу вчених привертають проблеми ввдедення генів азотфіксації в клітини рослин; створення ризоценозів між небобовими рослинами (особливо злаками) та азотфіксуючими організмами; підвищення потужності кореневої системи бобових рослин для збільшення на ній кількості бульб. Крім того, передбачається створення нових азотфіксуючих систем шляхом введення азотфіксуючих мікроорганізмів в калусні тканини рослин і як наслідок, утворення з них рослин-регенерантів, а також підвищення ефективності фіксації азоту шляхом впливу на гени, що контролюють цей процес.

Найбільш цікава перша проблема - введення nif-генів в клітини рослин. Однак її рішення зв’язане з рядом труднощів. Основна – руйнування нітрогенази під впливом кисню. У азотфіксуючих мікроорганізмів існує ряд пристосувань, що захищають бактерії від вільного кисню. Серед них присутність в клітинах бульб легоглобіну, який вбудовується в мембрану бактероїда (збільшена в розмірі бактеріальна клітина, яка характеризується найбільшою здатністю до фіксації азоту) та регулює надходження кисню. Легоглобин кодується в геномі рослинної клітини господаря, але його синтез починається тільки після проникнення бактерій в цю клітину. У ціанобактерій механізм захисту нітрогенази від кисню інший. Азотфіксація йде в гетероцистах, а фотосинтез – в звичайних клітинах. При цьому кисень який виділяється в процесі фотосинтезу, не інгібує фіксацію азоту. Таким чином, введення тільки nif-генів в якусь рослинну клітину не вирішує проблеми. Якщо нітрогенеза буде синтезуватися в цій клітині, зокрема в клітинах злаків, то вона зруйнується під дією кисню, присутнього в клітині. Крім того, сама клітина, в яку переносять гени азотфіксації може бути непристосована до синтезу та витрат більшої кількості енергії, яка потребується для фіксації азоту.

Таким чином, більш перспективним є підвищення ефективності фіксації азоту у вже існуючих природних системах за рахунок впливу на гени, які контролюють цей процес, а також збільшення потужності кореневої системи бобових рослин та створення нових азотфіксуючих систем за допомогою методів клітинної інженерії.