Спектрофотометрические методы

Спектрофотометрические методы определения АОЕ основаны на определении оптической плотности в специально подготовленных из объекта исследования пробах при определённой длине волны на приборе спектрофотометре. Данные методы расценивают как наиболее удобные и доступные для определения АОЕ, поэтому эта группа методов является самой многочисленной по сравнению с остальными.

Существуют различные спектрофотометрические методы определения антиоксидантной ёмкости:

1. Метод обесцвечивания каротиноидов, который основан на реакции обесцвечивания определённого вещества – кроцина-Н в присутствии антиоксидантов; измерения проводятся при длине волны 443 нм;

2. Метод с использованием катион-радикала АБТС, основанный на реакции обесцвечивания катион-радикала АБТС в присутствии антиоксидантов (конкретно – антиоксидантов фенольной природы); измерения проводятся при длине волны 734 нм ;

3. Методы, основанные на восстановлении ионов металлов переменных валентностей; методики основаны на образовании окрашенных продуктов восстановленных форм ионов металлов с соответствующими комплексонами, с помощью этих методик оценивается восстанавливающая активность некоторых металлов переменной валентности; при определении железо- восстанавливающей активности (метод Ferric Reducing Antioxidant Power) измерения проводятся при длине волны 700 и 490 нм, а при определении медь- восстанавливающей активности (метод Cupric Reducing Antioxidant Capacity) измерения проводятся при длине волны 450 нм;

4. Метод с использованием радикала ДФПГ, который основан на реакции обесцвечивания радикала ДФПГ в присутствии антиоксидантов; определения проводятся при длине волны 717 нм ;

5. Метод определения по малоновому диальдегиду, основанный на реакции между малоновым диальдегидом и 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием окрашенного комплекса; исследования проводятся при длине волны 532 нм .

Рассмотрим подробнее некоторые спектрофотометрические методы определения антиоксидантной ёмкости.

Метод с использованием катион-радикала абтс

Измерение антиоксидантной ёмкости основано на реакции обесцвечивания катион-радикала АБТС (2,2'-азино-ди-{3-этилбензтиазолин сульфонат}) в присутствии антиоксидантов, которые способны обрывать свободнорадикальные цепные реакции. Химическое соединение АБТС имеет максимум поглощения при длине волны 342 нм, он хорошо растворим в воде и химически стабилен. Генерация катион-радикала АБТС происходит ферментативно или неферментативно. Образование АБТС представлено на Рисунке 1.6. Полученный катион-радикал метастабилен и имеет характерный спектр поглощения и высокую оптическую плотность при длине волны 660, 734 и 820 нм. [5,6]

Данный метод сочетает оба механизма «гашения» радикалов, однако в кислой среде преимущественным становится механизм донирования протона, в то время как в щелочной среде преобладает транспорт электрона.

В данном методе используется система «АБТС – H₂O₂ – пероксидаза» с последующим взаимодействием катион-радикала АБТС с антиоксидантом, приводящим к уменьшению светопоглощения (антиоксиданты, содержащиеся в тестируемой пробе, подавляют развитие окраски пропорционально их концентрации в образце). Так происходит ферментативная генерация катион-радикала АБТС, для которой используются различные ферменты: пероксидазы (например, используется пероксидаза хрена), микропероксидазы и псевдопероксидазы (метгемальбумин, метмиоглобин и др.). Ферментативную генерацию можно представить следующими реакциями [4]:

HX-Fe^III + H₂O₂ Þ X-[Fe^IV=O] + H₂O, (10)

ABTS + X-[Fe^IV=O] Þ ABTS•⁺ + HX-Fe^III, (11)

где HX-Fe^III – используемый фермент в восстановленном виде;

X-[Fe^IV=O] – фермент в окисленном виде, здесь X – обозначение фермента – любого из вышеперечисленных.

Рисунок 1.2 - Образование катиона радикала АБТС

Неферментативная генерация катион-радикала АБТС может происходить по одной из следующих реакций:

ABTS + MnO₂→ ABTS•⁺, (12)

ABTS + K₂S₂O₈ → ABTS•⁺, (13)

ABTS + AAPH → ABTS•⁺. (14)

Полученный раствор, имеющий зелено-голубой цвет, чаще всего измеряют при 734 нм. Антиоксиданты, содержащиеся в тестируемой пробе, как уже отмечалось выше, подавляют развитие окраски пропорционально их концентрации в образце. При ферментативной генерации катион-радикал АБТС продуцируется непосредственно в реакционной среде. В связи с этим вещества, взаимодействующие с ферментами и/или субстратами (АБТС и H₂O₂), могут нарушать образование радикала и тем самым давать неадекватные значения АОЕ. Например, для ряда фенольных веществ, имеет место неспецифическое взаимодействие с пероксидазами, приводящее к снижению их активности. При предварительной неферментативной генерации катион-радикала АБТС вышеописанных сложностей не возникает. Дополнительными преимуществами этого метода является возможность работы в относительно широком диапазоне рН (3-5) и возможность использования различных растворителей. Недостатками данного метода является нефизиологичность используемого радикала, а также наличие различных конечных точек, не всегда позволяющее адекватно оценить АОЕ.