Классификация, морфология бактерий. Структура бактериальной клетки. Сложные методы окраски.

Прогресс в области клинической микробиологии и инфектологии в последние десятилетия расширил наши представления об известных возбудителях инфекционных болезней и позволил выявить ряд ранее неизвестных инфекций человека.

В связи с существенным расширением спектра возбудителей и нередко пересмотром роли некоторых из них в возникновении, развитии и распространении инфекций для практики все более актуальным становится вопрос о применении адекватных методов и средств выделения и точной идентификации возбудителя конкретного заболевания, а также адекватных средств этиотропной терапии и профилактики.

Успех классических методов обнаружения возбудителя инфекции зависит от правильного выбора вида и количества исследуемого материала, времени и техники его отбора, условий транспортирования, обработки, подбора методов и средств выделения и идентификации возбудителя. В каждом конкретном случае они определяются свойствами возбудителя, характером и стадией инфекции.

Следует подчеркнуть, что конечный результат исследования зависит не только (а иногда и не столько) от компетентности и адекватных действий микробиолога, но и от грамотности действий тех специалистов, которые имеют отношение к исследуемому материалу на до лабораторном этапе.

Не менее важное значение имеет правильная интерпретация врачами результатов микробиологического анализа, что также требует достаточных знаний о свойствах возбудителей инфекций человека. Многообразие возбудителей бактериальных инфекций не должно быть препятствием на пути рационального контроля за болезнями этой группы

Несмотря на широкую распространенность вирусных инфекций, бактерии остаются наиболее часто распознаваемыми этиологическими агентами инфекционных заболеваний. В связи с этим представляются важными вопросы таксономии бактерий – их описания, названия и идентификации.

Микроорганизмы - это невидимые простым глазом представители трех царств: Эукариоты, Прокариоты, Вирусы.

Прокариотическая клетка имеет средние размеры 1-10 мкм, генетический материал представлен кольцевой молекулой ДНК, расположенной свободно в цитоплазме, нет ядерной мембраны, отграничивающей генетический материал от цитоплазмы, гистоны отсутствуют. Синтез белка происходит на рибосомах 70 S, свободно расположенных в цитоплазме. Тип деления - бинарный. Клеточная стенка образована пептидогликаном. Анаэробное дыхание возможно.

Эукариотическая клетка имеет средние размеры 10-100 мкм. Генетический материал отграничен от цитоплазмы ядерной мембраной, имеет форму хромосомы, гистоны имеются, синтез белка осуществляется на рибосомах 80 S. Рибосомы находятся в составе эндоплазматической сети. Тип деления - митотический. Клеточная стенка (если есть) содержит хитин или целлюлозу. Имеются стеролы. Анаэробное дыхание отсутствует.

К прокариотам относятся бактерии (в т. ч. актиномицеты, цианобактерии, спирохеты, риккетсии, хламидии, микоплазмы) и архебактерии.

К эукариотическим микроорганизмам относятся грибы, простейшие, одноклеточные водоросли.

Вирусы - не имеют клеточного строения.

Таким образом, бактерии имеют следующие обязательные структуры:

• клеточную стенку (за исключением микоплазм),

• цитоплазматическую мембрану,

• цитоплазму,

• нуклеоид,

• рибосомы.

Необязательные (непостоянные структуры бактериальной клетки):

• капсула,

• жгутики,

• споры,

• включения в цитоплазме.

Биологическая классификация бактерий неоднократно пересматривалась. Принципы идентификации, изложенные в Определителе бактерий Берджи, 9-е издание которого вышло в 1994 г., нашли наибольшее распространение в практической бактериологии. В соответствии с ними (на основе строения клеточной стенки и отношения к окраске по Граму) бактерии разделены на 35 групп, входящих в 4 категории:

I – грамотрицательные эубактерии;

II – грамположительные эубактерии;

III – эубактерии, лишенные клеточной стенки – микоплазмы (Mollicutes);

IV – археобактерии (Archaea).

Кроме того, Основой определения систематического положения являются:

• морфология и

• тинкториальные свойства клеток (форма, размеры, взаимное расположение, спорообразование, окраска по методу Грама и другими методами),

• культуральные,

• биохимические,

• антигенные характеристики, а также

• чувствительность к различным антимикробным воздействиям и

• степень генетического родства с представителями других таксонов (по процентному соотношению содержания гуанина и цитозина в геноме, гомологии нуклеиновых кислот и способности к обмену генетической информацией).

По уровню биологической организации бактерии стоят ниже эукариотических организмов (грибов, простейших, гельминтов).

Несмотря на введение новых методов таксономических исследований, вопрос о полной и всеобъемлющей классификации бактерий остается до конца нерешенным. Даже истинное родство, выявленное по гомологии нуклеиновых кислот, свидетельствует лишь о наличии общего предка и может быть оспоренным.

Наибольшее практическое значение имеют схемы идентификации, основанные на морфофизиологических, тинкториальных, метаболических и других легко выявляемых свойствах бактерий. Определение этих свойств в ходе диагностики позволяет не только выделять и идентифицировать чистые культуры, но и дифференцировать их с представителями сопутствующей микрофлоры, не связанными с заболеванием. Более того, даже начальные этапы исследования могут дать ценную информацию для выбора средств этиотропной терапии.

Морфология и тинкториальные свойства. По морфологическому принципу бактерии разделяют на:

• шаровидные (кокки),

• палочковидные (овоидные, коккобациллы, прямые, изогнутые, вибрионы, с закругленными, заостренными, "обрубленными" концами, ветвящиеся, нити)

• извитые формы (спиралевидные с одним или более завитками).

В зависимости от расположения в микропрепарате различают:

• одиночные,

• попарно расположенные клетки (диплококки),

• в виде тетрад (тетракокки),

• цепочек (стрептококки, стрептобациллы),

• пакетов (сарцины),

• беспорядочных скоплений (стафилококки).

ОСНОВНЫЕ КЛАССИФИКАЦИОННЫЕ ПОНЯТИЯ

• ВИД – эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющая единый генотип, проявляющийся сходными фенотипическими признаками.

• ВАРИАНТ (ВАР) - особи одного вида, различающиеся по разным признакам (серовары, хемовары, культивары, морфовары, фаговары).

• ПОПУЛЯЦИЯ - совокупность особей одного вида, относительно длительно обитающих на определенной территории.

• КУЛЬТУРА - совокупность бактерий одного вида (чистая) или нескольких видов (смешанная), выращенная на питательной среде (жидкой или плотной).

• КОЛОНИЯ – видимое скопление бактерий одного вида на поверхности или в глубине плотной питательной среды.

• ШТАММ - чистая культура одного вида бактерий, выделенная в определенное время из одного источника.

• КЛОН - культура клеток, выращенная из одного микроорганизма методом клонирования.

Окрашивание препаратов проводится с помощью красителей, которые можно разделить на позитивные (метиленовый синий, фуксин) и негативные (нигрозин). Позитивными называются красители, окрашивающие микроорганизмы и другие находящиеся на стекле фиксированные объекты, негативными - красители, заполняющие пространство, окружающее микроорганизмы, в результате чего последние становятся видимыми в виде силуэтов на фоне красителя; кислые (эозин, конго красный) и щелочные (гематоксилин, толуидиновый синий, азур). Кислые красители связываются с веществами, имеющими щелочную реакцию (например, цитоплазматическими белками). Щелочные - связываются с базофильными (кислыми) компонентами клеток (нуклеиновыми кислотами, рибосомами).

Основные цвета окрашивания могут быть следующими:

а) красный (основной фуксин, кислый фуксин, сафранин, конго-красный);

б) фиолетовый (генциановый фиолетовый, метиловый фиолетовый, кри­сталлический фиолетовый);

в) синий (метиленовый синий, толуидиновый синий, водный синий);

г) зеленый (малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый).

Способность клеток воспринимать различные красители отражает их тинкториальные свойства. Это определяется структурой и составом клеточной стенки.

Простыми методами окрашивания называют окрашивание препаратов каким-либо одним красителем. Чаще всего при этом используется фуксин, генциановый фиолетовый, метиленовый синий.

При сложных методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие - дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др., которые играют роль дифференциаторов. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, запасные вещества, включения и т.д.)

Наибольшее значение для идентификации имеет использование сложных (дифференцирующих) методов, в первую очередь метода Грама, позволяющего различить:

• грамположительные

• грамотрицательные бактерии.

При окраске этим методом грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в бордово-красный, что отражает различия в строении клеточных стенок бактерий двух групп.

На основании результатов микроскопии окрашенных по методу Грама препаратов из патологического материала можно ориентировочно судить о составе микрофлоры и степени микробной обсемененности материала, что позволяет выбрать более адекватные методы и средства диагностики и начальной антимикробной терапии. Так, например, при обнаружении стрептококков препаратом выбора должен быть пенициллин.

Результаты параллельного выделения и идентификации возбудителя с дальнейшим определением чувствительности уточняют сделанный выбор.

Из других методов часто используют окраску по Цилю–Нильсену, позволяющую выявить кислотоустойчивые формы бактерии (Mycobacterium spp., Nocardia spp.) и споры (покоящиеся формы). Например, микобактерии туберкулеза окрашиваются в красный цвет, а некислотоустойчивые клетки – в синий.

По наличию особых (необязательных) структурных элементов различают бактерии:

• спорообразующие (Clostridia spp., Bacillus spp.) и аспорогенные (энтеробактерии и др.);

• капсулированные (Klebsiella spp., S.pneumoniae, B.anthracis и др.);

бескапсульные (Vibrio spp., Brucella spp. и др.);

• подвижные (образующие жгутики), например многие грамотрицательные палочки и неподвижные (многие кокки).

Полиморфизм бактерий. Морфология бактерий даже в пределах одного вида достаточно изменчива, что связано с высокой приспособляемостью к условиям существования. Даже при микроскопии окрашенного мазка из чистой культуры бактерий обнаруживаются клетки различной величины и расположения, неодинаково воспринявшие краситель. Эти особенности могут быть объяснены различными сроками с момента деления клетки, условиями питания, действием продуктов метаболизма" и другими факторами. При действии некоторых химических веществ, химиотерапевтических препаратов, антибиотиков или воздействии повышенной температуры, ультрафиолетовых лучей происходят глубокие изменения в морфологии бактерий: клетки могут превращаться в длинные нити, ветвистые формы, иметь колбовидные вздутия на концах и т.д

Сложные методы окраски используются для выявления отдельных структур клетки и требуют применения двух и более красителей и воздействия некоторых дополнительных веществ и физических факторов.

К сложным методам окраски относятся:

по Романовскому-Гимзе;

по Граму;

по Нейссеру;

по Цилю-Нильсену и др.

Метод Романовского-Гимзе

Окраска эукариотических клеток осуществляется методом Романовского-Гимзе. Этот метод широко применяется для:

• изучения различных деталей эукариотической клетки (а первую очередь- ядра);

• для подсчета форменных элементов крови (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов);

• для обнаружения простейших, грибов, внутриклеточных паразитов (риккетсий, хламидий),

• для обнаружения спирохет в крови.

Метод Грама является универсальным методом окраски и рекомендуется для окраски прокариотических клеток. Все бактерии по отношении к этому методу делятся на две группы:

• грамположительные (стафилококки,стрептококки, сарцины, коринебактерии, клостридии, бациллы и другие, окрашивающиеся в фиолетовый цвет)

• грамотрицательные (эшерихии, псевдомонады, нейссерии, сальмонеллы, клебсиеллы, протеи и другие, окрашивающиеся в розовый цвет).

У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) является муреин (пептидогликан), в соединении с тейхоевой кислотой и рубонуклеатом магния. Он располагается в три слоя.

У грамотрицательных бактерий пептидогликан однослойный, его меньше в клеточной стенке (около 10%), а основной компонент представлен липополисахаридами. Тейхоевых кислот нет.

Проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Поэтому образовавшийся комплекс: генциан виолета, йода и пептидогликана у грамположительных бактерий удерживается в клеточной стенке при обработке этиловым спиртом, тогда как грамотрицательные бактерии теряют этот комплекс, обесцвечиваются спиртом и затем докрашиваются водным фуксином в розовый цвет.

Бактерии, потерявшие клеточную стенку частично или полностью, называются протопластами, сферопластами, L-формами. Метод Грама не может быть применен для их идентификации.

Метод Нейссера

В цитоплазме бактерий могут находиться различные по своей природе включения, такие как липопротеидные тельца, гликоген, гранулеза, пигментные скопления, сера, кальций. У некоторых бактерий в цитоплазме встречаются зерна волютина. Включения волютина хорошо выражены у Spirillum volutans, по наименованию которых волютин получил название, у Bacillus subtilis, а также у возбудителей сибирской язвы и дифтерии. Гранулы волютина имеют относительно крупные размеры, окрашиваются различными красителями, изменяя цвет последних. Например, при окрашивании метиленовым синим волютин окрашивается в ярко-красный цвет (например, при окраске по методу Леффлера). Такое явление получило название метахромазии. Гранулы волютина представлены полифосфатами — запасным веществом, которое служит источником фосфатных групп. Наличие гранул волютина учитывают при лабораторной диагностике дифтерии, так как для этого возбудителя характерно биполярное расположение зерен. Метод Нейссера, используемый для выявления зерен волютина, основан на избирательной фиксации зернами волютина уксусно-метиленовой синьки Нейссера. При последующем окрашивании везувином зерна волютина, прочно фиксировавшие метиленовую синьку, остаются темно-синего (почти черного) цвета, а цитоплазма приобретает желтый цвет.