Практическая часть

Клетки микроорганизмов измеряют под микроскопом с по­мощью окулярной линейки — микрометра или окулярного винто­вого микрометра. Для измерения лучше использовать живые, а не фиксированные клетки, так как фиксация и окраска клеток при­водят к некоторому изменению их истинных размеров. Удобно оп­ределять размеры клетки, пользуясь фазово-контрастным устрой­ством. Если клетки подвижны, препарат слегка подогревают или к капле исследуемой суспензии добавляют каплю 0,1%-ного водного раствора агара. Размеры клеток выражают в микрометрах (мкм). Один микро­метр равен 1000 нанометров (нм). В нанометрах выражают размеры отдельных компонентов бактерий.

Окулярный микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку, в центре которой выгравирована линейка длиной 5 мм. Линейка разделена на 50 частей. Окулярный микро­метр вставляют в окуляр. Для этого вывинчивают глазную линзу окуляра, помещают на его диафрагму окулярный микрометр де­лениями вниз и завинчивают линзу. Однако делениями окуляр-микрометра нельзя непосредственно измерить величину клетки, так как последние рассматриваются через объектив и окуляр, а деления линейки — только через верхнюю линзу окуляра. Поэто­му, прежде чем приступить к измерению величины клеток, необ­ходимо определить цену деления окулярного микрометра для дан­ного увеличения микроскопа, что делают с помощью объективно­го микрометра.

Рис. 5. Объективный микрометр а — общий вид, б — вид под мик­роскопом

Объективный микрометр (рис. 5) — это металли­ческая пластинка с отверстием в центре. В отверстие вставлено стекло, на которое нанесена линейка длиной 1 мм. Она разделена на 100 частей, т. е. деление объективного микрометра соответст­вует 0,01 мм, или 10 мкм. Для определения цены делений окуляр­ного микрометра объективный микрометр помещают на столик микроскопа и фокусируют при малом увеличении. Изображение линейки перемещают в центр поля зрения и только после этого меняют объектив на тот, при ко­тором будут определяться раз­меры клеток. Перемещая столик микроскопа и поворачивая оку­ляр, устанавливают микрометры так, чтобы их шкалы были па­раллельны и одна перекрывала другую. Цену деления окуляр­ного микрометра определяют по принципу нониуса, т. е. совме­щают одно из делений шкалы окулярного и объективного микрометров и находят следую­щее их совмещение (рис. 6).

Рис 6. Определение це­ны деления объективного микрометра: 1 - деление объективно­го микрометра; 2 - де­ление окулярного микро­метра

Устанавливают, скольким деле­ниям объективного микрометра соответствует 1 деление окулярного микрометра. Например, 2 деления объект-микрометра (20 мкм) соответст­вуют 5 делениям окуляр-микрометра, следовательно, 1 деление окуляр-микрометра равняется 4 мкм (20:5). Если те­перь на столик микроскопа положить препарат с клетками микроорганизмов и рассматривать его при том же увеличе­нии, то можно измерить величину клетки. Для этого определяют, какому числу делений окулярной линейки соответст­вует величина измеряемого объекта, и умножают это число на цену деления окулярного микрометра.

Удобно определять размеры клеток с помощью винтового окулярного микрометра MOB-1-15. Винтовой окулярный микрометр закрепляют на тубусе микроскопа, предварительно вынув окуляр. В окуляре винтового микрометра имеется неподвиж­ная шкала с ценой деления 1 мм для определения размеров крупных объектов и подвижная стеклянная пластинка с перекрес­тием. Пластинка связана с микрометрическим винтом-барабаном и перемещается вместе с перекрестием при его вращении. Для из­мерения длины клетки вращением микрометрического винта-бара­бана окулярного микрометра подводят перекрестие к концу клетки и отмечают деление на барабане. Затем, вращая барабан, пере­мещают перекрестие до другого конца клетки и вновь отмечают деление на барабане. Определяют, скольким делениям микромет­рического винта-барабана соответствует длина клетки, и умножа­ют полученное значение на цену деления барабана при данном увеличении микроскопа.

Цену деления барабана для каждого объектива определяют с помощью объективного микрометра. С этой целью подводят пере­крестие к началу одного деления объективного микрометра и от­мечают деление на барабане. Затем, вращая барабан, перемеща­ют перекрестие до конца деления объективного микрометра и вновь отмечают деление на барабане. Определяют, скольким де­лениям микрометрического винта-барабана соответствует 1 деле­ние объективного микрометра. Например, 1 деление объективного микрометра, т. е. 10 мкм, соответствует X делениям микрометри­ческого винта-барабана, следовательно, 1 деление его при данном увеличении микроскопа равно 10 : Х мкм.

Чтобы результаты были достоверными, необходимо измерить не менее 20—30 клеток. При определении размеров округлых форм измеряют диаметр клеток, у других форм — длину и шири­ну, указывают средние размеры клеток и пределы колебаний, т.е. минимальные и максимальные размеры.

Контрольные вопросы

1. Укажите, в каких размерных границах находятся микроорганизмы. Какие единицы измерения используют в данном случае?

2. Какие приспособления используют для определения размеров микроорганизмов?

3. Что такое окуляр-микрометр?

4. Что такое объект-микрометр?

5. Как определить цену деления?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4

ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ БАКТЕРИЙ

Цель работы: Изучить различные морфологические формы бактерий, освоить методы простого окрашивания прокариотных клеток.

Оборудование, материалы: Световой микроскоп, фазово-контрастный микроскоп, суточная бульонная культура бактерий, предметные стекла, покровные стекла, иммерсионное масло, фуксин, генциан-виолет, сафранин, фильтровальная бумага, бактериологические петли, спиртовка.

Теоретические сведения

До недавнего времени большинство исследователей традици­онно считали, что клетки прокариот достаточно однообразны и в подавляющем большинстве имеют форму сферы, цилиндра или спирали. Они бывают одиночными, в иных случаях образуют нити или колонии (Рис 7).

Рис 7. Представители наиболее распространенных морфотипов бакте­рий (микрофотографии в фазово-контрастном микроскопе): 1 — кокки (Thiocapsa roseopersicina, диаметр отдельных клеток - 1,5 мкм); 2 — палочки (Desulfotomaculum acetoxidans, диаметр - 1 мкм); 3 — спириллы Rhodospirillum rubrum диаметр - 1 мкм); 4 — спирохеты (Spirochaeta stenostrepta, диаметр - 0,25 мкм); 5— почкующиеся клетки с выростами (гифы и отростки, диаметр - 1,2 мкм); 6— нитевидные клетки (Chloroflexus sp., диаметр - 1.8 мкм)

Кокковидные бактерии (кокки) — шаровидные клет­ки размером 0,5—1,0 мкм, которые в зависимости от взаимного расположения делятся на микрококки, диплококки, стрептококки, тетракокки, сарцины и стафилококки. Микрококки представляют собой отдельно расположенные клетки. Диплококки или парные кокки, располагаются парами (пнев­мококк, гонококк, менингококк), так как клетки после деле­ния не расходятся. Пневмококк (возбудитель пневмонии) имеет с противоположных сторон ланцетовидную форму, а гонококк (возбудитель гонореи) и менингококк (возбудитель эпидеми­ческого менингита) имеют форму кофейных зерен, обращенных вогнутой поверхностью друг к другу. Стрептококки (от греч. streptos — цепочка) — клетки округлой или вытянутой формы, составляющие цепочку вследствие деления клеток в одной плоскости и сохранения связи между ними в месте деления. Сарцины (от лат. sarcina — связка, тюк) располагаются в виде пакетов из 8 и более кокков, так как они образуются при делении клетки в трех взаимно перпендикулярных плоскостях.

Стафилококки (от греч. staphyle — виноградная гроздь) пред­ставляют собой кокки, расположенные в виде грозди винограда в результате деления в разных плоскостях (Рис. 8).

Рис 8. Типы группирования сферических клеток: 1 — диплококки; 2 — стрептококки: 3 — тетракокки и сарцины; 4 — стафило­кокки и микрококки

Палочковидные бактерии (палочки) различаются по размерам, форме концов клетки и взаимному распо­ложению клеток. Длина клеток варьирует от 1,0 до 8,0 мкм, толщина — от 0,5 до 2,0 мкм. Палочки могут быть правильной (кишечная палочка и др.) и неправильной (коринебактерии и др.) формы, в том числе ветвящиеся, например у актиномицетов. К наиболее мел­ким палочковидным бактериям относятся риккетсии. Концы палочек могут быть как бы обрезанными (сибиреязвенная ба­цилла), закругленными (кишечная палочка), заостренными (фузобактерии) или в виде утолщения и тогда палочка похожа на булаву (коринебактерии дифтерии).

Слегка изогнутые палочки называются вибрионами (холер­ный вибрион). Большинство палочковидных бактерий распола­гается беспорядочно, так как после деления клетки расходятся. Если после деления клетки остаются связанными общими фраг­ментами клеточной стенки и не расходятся, то они располага­ются под углом друг к другу (коринебактерии дифтерии) или образуют цепочку (сибиреязвенная бацилла).

Извитые формы — спиралевидные бактерии, напри­мер спириллы, имеющие вид штопорообразно изви­тых клеток. К извитым также относятся кампилобактеры, име­ющие изгибы как у крыла летящей чайки; близки к ним и такие бактерии, как спирохеты. Спирохеты — тонкие, длинные, извитые (спирале­видной формы) бактерии, отличающиеся от спирилл подвижностью, обусловленной сгибательными измене­ниями клеток. Спирохеты состоят из наружной мембраны (клеточной стенки), окружающей протоплазматический цилиндр с цитоплазматической мембраной и аксиальной нитью (аксистиль). Аксиальная нить находится под наружной мембраной клеточной стенки и как бы закручивается вокруг протоплазматического цилиндра спирохе­ты, придавая ей винтообразную форму (первичные завитки спирохет). Аксиальная нить состоит из фибрилл — аналогов жгутиков бактерий и представляет собой сократительный белок флагеллин. Фибриллы прикреплены к концам клетки и направ­лены навстречу друг другу. Другой конец фибрилл свободен. Число и расположение фибрилл варьируют у разных видов. Фибриллы участвуют в передвижении спирохет, придавая клеткам враща­тельное, сгибательное и поступательное движение. При этом спирохеты образуют петли, завитки, изгибы, которые названы вторичными завитками.

За последнее время среди прокариот обнаружены организмы, отличающиеся от описанных выше основных форм. Некоторые бактерии имеют вид кольца, замкнутого или разомкнутого в за­висимости от стадии роста.

Риккетсии — мелкие грамотрицательные палочко­видные бактерии размером 0,35—2,0 мкм, облигатные внутриклеточные паразиты. Форма и размер риккетсии могут меняться (клетки неправиль­ной формы, нитевидные) в зависимости от условий роста. Хламидии, или гальпровии, относятся к облигатным внутриклеточным кокковидным грамотрицательным бактериям. Вне клеток хламидии имеют сферическую форму (0,3 мкм), являясь элементарными тельцами. Внутри клеток они превращаются в делящиеся ретикулярные тельца, образуя скоп­ления (включения). Микоплазмы — мелкие бактерии, окруженные цитоплазматической мембраной и не имеющие клеточной стенки. Они относятся к отделу тенерикутов, классу Mollicutes («мяг­кокожие»). Из-за отсутствия клеточной стенки микоплазмы осмотически чувствительны и имеют разнообразную форму: кокковидную, нитевидную, колбовидную. Эти формы видны при фазово-контрастной микроскопии чистых культур микоплазм. Актиномицеты — ветвящиеся грамположительные бактерии. Свое название (от греч. actis — луч, mykes — гриб) они по­лучили в связи с образованием в пораженных тканях друз — гранул из плотно переплетенных нитей в виде лучей, отходя­щих от центра и заканчивающихся колбовидными утолщениями. Актиномицеты, как и грибы, образуют мицелий — нитевидные переплетающиеся клетки (гифы) (Рис. 9).

Рис. 9. Мицелиальные организмы при одинаковом увеличении: 1 — почвенный актиномицет; 2 — почвенные грибы.

Они формируют субстратный мицелий, образующийся в результате врастания клеток в пи­тательную среду, и воздушный, растущий на поверхности сре­ды. Общую филогенетическую ветвь с актиномицетами образуют так называемые нокардиоподобные (нокардиоформные) актиномицеты — собирательная группа палочковидных, неправильной формы бактерий (Рис. 10).

Рис. 10. Клетки нокардии на разных фазах роста культуры: 1 — 2-суточная: 2 — 4-5-суточная; 3 — 7- 8-суточная

Их отдельные представители образуют ветвя­щиеся формы. К ним относят бактерии родов Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia и др (Рис. 11 и 12).

Рис. 11. Формы клеток микобактерий: 1 — суточная культура; 2 — 2-суточная; 3 — 3-4-суточная; 4 — 10-суточная

Рис. 12. Изменение формы клеток Arthrobacter (1) и клетки Corynebacterium (2).

У прокариот, в основном размножающихся почкованием, описано образование клеточных выростов (простек), число которых может колебаться от 1 до 8 и более (рис. 13) .

Рис. 13. Бактерии с различными выростами: 1 — Caulobacter sp.; 2 — Hyphomicrobium sp.; 3 — Ancalomicrobium sp.; 4 — Gallonella sp.

Из природных субстратов выделены бактерии червеобразной формы и напоминающие шестиугольную звезду. Для некоторых видов характерно слабое или до­вольно хорошо выраженное ветвление. Форма многоклеточных прокариот также разнообразна: это скопления различной конфигурации, чаще — нити (рис. 14).

Рис. 14. Различные формы нитчатых бактерий:

1 — Beggiatoa; 2 — Thiothrix; 3 — Saprospira; 4 — Simonsiella; 5 — Caryophanon; 6 — цианобактерии рода Microcolеus; 7 — Leptothrix; 8 — Sphaerotilus; 9— Crenothrix