Накопичення та виявлення вірусів на культурі клітин

Досліджуваний матеріал, в якому припустимо знаходиться цікавлячий нас вірус, суспендують в невеликому об’ємі культурального середовища, фільтрують через міліпоровий фільтр для видалення бактерій і вносять в культуральний флакон, який містить моношарову культуру сприйнятливих клітин. Через 48 – 72 години реєструють появу змін. Простим оком видно повну чи часткову деградацію моношару і його злущування з поверхні флакона. Морфологічні зміни клітин виявляють за допомогою інвертованого мікроскопа.

Зараження курячих ембріонів

Повітряний мішок

Хоріоналан-тоїсна мембрана

Алантоїсна порожнина

Жовточний мішок

Білок

Інокуляція у хоріоналантоїсну мембрану

Інокуляція у алантоїсну порожнину

Досліджуваний матеріал вводять в алантоїсну чи амніотичну порожнини, хоріоналантоісну оболонку або жовтковий мішок курячого ембріона. Перед зараженням шкаралупу яйця дезінфікують етанолом і йодом. На овоскопі встановлюють межі повітряної камери, розтинають її та шприцем 0,1 – 0,2 мл досліджуваного матеріалу на 2 – 3 мм нижче межі повітряного пухирця. Отвір в шкарулупі заліплюють. Розтин заражених ембріонів здійснюють через 48 – 72 години інкубації при 37С. Шкаралупу знову оброблюють спиртом і 2 % розчином йоду, розтинають її ножицями, знімають її оболонку і вивчають хоріон-алантоісну оболонку в районі зараження, відмічаючи геморрагії та інші ураження.

Виявлення вірусів в клітинних культурах

та їх ідентифікація.

Існують первинно-трипсоннізовані та перещеплювані клітинні культури. Первинно-трипсонізовані культури отримують безпосередньо із тканини тварини чи людини шляхом руйнування трипсином міжклітинної речовини. Отримані таким чином клітини переносять в посудину з поживним (культуральним) середовищем, в якому вони зберігають життєздатність на протязі ряду генерацій, завдяки чому їх можна кілька разів пасировать. Такі первинні культури високочутливі до ряду вірусів і широко використовуються в вісурології.

Перещеплювані культури здатні витримувати необмежену кількість пасажів, оскільки отримані із трансформованих або пухленних клітин.

По характеру росту культури діляться на моношарові та суспензійні. Добре прикріплюються до підложки і ростуть в моношарі епітеліальні клітини та фібробласти. Клітини системи крові формують, як правило, суспензійні лінії. Живильні середовища, що використовуються для культур клітин, можуть бути ростовими та підтримувальними. Ростові містять поряд з іншими компонентами 5-15% сироватки кровітварин і сприяють розмноженню клітин, швидкому росту й формуванню моношарових культур. Для виживання клітин у вже сформованому моношарі використовують підримувальні середовища, де міститься близько 2% сироватки крові тварин. Також існує класифікація живильних середовищ за походженням: природні та синтетичні.

Виявлення ( індикація ) вірусів

Цитопатична дія ( ЦПД ) (індикація вірусів на культурі клітин) являє собою дегенеративні зміни в клітинах, які з’являються в результаті репродукції в них вірусів. Характер ЦПД залежить в основному від :

• виду вірусу;

• дози вірусу;

• властивостей клітин та умов їх культивування.

Розрізняють повну і часткову дегенерацію клітин моношару. При повній дегенерації відбувається тотальний некроз клітин і злущування моношару. Такою дією володіють віруси поліомієліту, Коксакі.

Часткова дегенерація клітин має кілька різновидів:

1. вогнищева деструкція – на фоні збереженого

моношару з’являються вогнища дегенерації (викликається вірусами віспи, вісповакцини, грипу);

2. гроноутворення – клітини округлюються, збільшуються, частково зливаються між собою з утворенням характерних гроноподібних скупчень (викликаються аденовірусами);

3. симпластоутворення – під дією вірусів клітини зливаються між собою з утворенням гігантських багатоядерних клітин – симпластів (чи синцитіїв), це характерно для вірусів кору, паротиту, герпесу, парагрипу, респіраторно-синцитіальних та ін.;

4. трансформація клітин – онкогенні віруси здатні трансформувати клітини моношарових культур з утворенням фокусів проліферації.

Внутрішньоклітинні включення (індикація вірусів на культурі клітин) утворюються при репродукції деяких вірусів в цитоплазмі і ядрі клітин ( віспи, сказу, грипу, герпесу та ін. ). Динаміка їх формування, їхня форма, розмір, субклітинна організація, наявність у них вірусспецифічних нуклеїнових кислот і білків мають важливе діагностичне значення. Включення можна виявити при мікроскопії препаратів.

Утворення бляшок (метод негативних колоній). Цей метод дозволяє проводити кількісне визначення вірусів. Для виявлення вірусів використовують моношарові культури, які з аражають матеріалом, що містить вірус та покривають шаром агару з індикатором. Чашки (флакони) інкубують при 37⁰С. Через 48-72 одини виявляють плями-бляшки. Ці плями виникають за рахунок ЦПД вірусу.

Реакція гемаглютинації (РГА) (індикація вірусів на курячих ембріонах)

Після розтину курячого ембріона алантоісну рідину відсмоктують і розливають в комірки планшету по 0,5 мл ( для контролю беруть 0,5 мл такої ж рідини незараженого ембріона). Потім додають по 0,2 мл 1 % суспензії відмитих курячих еритроцитів та інкубують при кімнатній температурі. Результати реакції враховують через 40 хв. після осідання еритроцитів:

+ + + + - виражена гемаглютинація – тонка плівка склеєних еритроцитів на дні, яка має вигляд парасольки,

+ + + – наявність просвітів в плівці,

+ + – плівка із склеєних еритроцитів має фестончаті краї,

+ – пластівцеподібний осад еритроцитів, оточений невеликою кількістю аглютинованих еритроцитів.

У разі позитивної реакції гемаглютинації, якщо в алантоїсній рідині присутній вірус, відбувається утворення комплексу курячий еритроцит + вірус (гемаглютинація), який віруально можна побачити у комірці планшетки у вигляді осаду з неровними краями – „парасольки”. Якщо вірус, здатний до гемаглютинації у алантоїсній рідині, відсутній, то у комірці спостерігається утворення осаду з ровними краями - „гудзика”

еритроцит вірус гемаглютинація

Схема позитивної РГА

- - різко окреслений осад еритроцитів, що не відрізняється від контролю. Наявність гемаглютинації в дослідних комірках при її відсутності в контрольних вказує на вміст віруса в досліджуваній рідині.

Реакція гемадсорбції (РГадс) (індикація вірусів на культурі клітин) РГадс дозволяє виявити вірус до розвитку ЦПД завдяки появі на поверхні інфікованої клітини вірусспецифічного антигену. При цьому еритроцити адсорбуються на інфікованих клітинах моношару.

Еритроцит

При мікроскопії моношару культури клітин на яку наносили вірусвмісний матеріал від хворого у позитивному випадку спостеріається ефект гемадсорбції в наслідок здатності вірусінфікованих клітин адсорбувати на своїй поверхні курячі еритроцити (за рахунок наявності на поверхні клітин вірусних антигенів).

При негативному результаті (коли у матеріалі не було вірусу) не відбувається адсорбції еритроцитів.

Ідентифікація вірусів

Ідентифікація вірусів здійснюється за допомогою специфічних противірусних антисироваток в РН, РГГадс, РПГ, РІФ та ін. Ті ж реакції можна використовувати при серологічній діагностиці для виявлення антитіл в сироватках крові хворих.

Реакція нейтралізації ( РН )

РН основана на пригніченні цитопатогенного ефекту в культурі клітин після змішування зі специфічними сироватками (антитілами). РН інфекційної і цитопатичної дії вірусів здійснюється на чутливих до вірусу живих системах та культурах клітин. З матеріалу, що містить вірус, готують серійні розведення і обробляють специфічною сироваткою, після чого цією сумішшю заражують культуру тканини, курячі ембріони чи лабораторних тварин. Контролем є чутлива система, заражена вірусом, оброблена нормальною сироваткою. Позитивною вважають РН при відсутності ЦПД в культурі клітин, змін в курячих ембріонах, захворювання чи загибель тварин. Оскільки більшість середовищ, що використовуються для культивування еукаріотичних клітин, містять індикатор, оцінити реакцію нейтралізації можна по зміні (чи його відсутності) кольору середовища – кольорова РН.

Реакція гальмування гемадсорбції ( РГГадс ) використовується для ідентифікації гемадсорбуючих вірусів і визначення титру антитіл в сироватках. Для постановки цієї реакції використовують матеріал від хворої людини, специфічні імунні сироватки та культуру клітин. На першому етапі цієї реакції матеріал від хворого змішують зі специфічними імунними сироватками і таку суміш наносять на культуру клітин.

Інтерпретація результатів проводиться наступним чином:

Позитивна реакція - відсутність адсорбції еритроцитів на культурі клітин. Такий результат утворюється у випадку коли вірус з матеріалу від хворого нейтралізується антитілом специфічної імунної сироватки. При нанесенні такої суміші на культуру клітин вірус вже не здатен проникати у клітину, не залишає на її поверхні специфічні антигені, і на ній не адсорбуються курячі еритроцити.

Нейтралізація віруса

антитілами імунної

сироватки

внесення на 1 нанесення курячих

еритроцитів В

культуру клітин 2 промивання

3 мікроскопія

При позитивній реакції не відбувається адсорбції еритроцитів

Схема позитивної РГГАдс

При негативній реакції внаслідок того, що на першому етапі не відбулося нейтралізації вірусу антитілом імунної сироватки, вірус проникає в клітину і при нанесенні курячих еритроцитів відбувається гемадсорбція.

Реакція гальмування гемаглютинації ( РГГА ) базується на блокуванні гемаглютиніна – віруса антитілами специфічної імунної сироватки.

Н

еритроцити антитіла вірус нейтралізація вірусів

спец.сир-ки антитілами і гальмування

гемаглютинації

Схема позитивної РГГА

а першому етапі данної реакції вірусвмісний матеріал від хворої людини змішують зі специфічними імунними сироватками, потім додають курячі еритроцити.

При позитивному результаті, тобто коли вірус нейтралізується антитілом специфічної імунної сироватки, не відбувається гемаглютинації і курячі еритроцити осідають на дно комірки пластикої планшетки у вигляді осаду з ровними краями – „гудзика”.

При негативній реакції – нейтралізація віруса антитілами специфічної імунної сироватки не відбувається, тому у комірці спостерігається ефект гемаглютинаці – осад у вигляді „парасольки”.

Імуноферментний аналіз ( ІФА ) став одним з провідних методів у експрес-діагностиці вірусних інфекцій. Частіше всього застосовується його твердофазний сендвіч-варіант. Діагностичні набори для ІФА містять пластикові 96-комірчасті планшети, на дні комірок яких фіксовані специфічні антитіла. При додаванні в комірку досліджуваного матеріалу з відповідним вірусом останній зв’язується з антитілом. На другому етапі у відмиті комірки додають моноклональні чи монорецепторні антитіла з прікріпленою до них молекулою ферменту (пероксидази або лужної фосфатази). Оскільки моноклональні антитіла (МкАТ) спрямовані на один із етапів складного вірусного антигену, вони не конкурують з полівалентною сироваткою, яка зв’язує антиген. Після додавання індикатора і відповідного субстрату, відбуваеться зміна ( від жовтого до коричневого) забарвлення внаслідок зміни рН (розщеплення субстрату). Забарвлення, що з’являється, аналізують на багатоканальних спектрофотометрах.

Реакція імунофлюоресценції ( РІФ ) в прямому і непрямому варіантах також досить широко застосовується для ідентифікації вірусів і ще частіше для експресс-діагностики вірусних захворювань.

Прямий метод РІФ – як еспресс метод для діагностики вірусних інфекцій, оснований на тому, що віруси з матеріалу від хворого оброблені імунними сироватками з антитілами, міченими флуорохромом, здатні світитися в УФ-променях люмінісцентного мікроскопу.

Непрямий метод РІФ оснований на виявленні комплексу антиген (вірус)-антитіло за допомогою антиглобулінової (проти антитіл) сироватки, міченої флуорохромом.