2. Окраска микроорганизмов по граму

Метод предложен датским ученым Грамом в 1884 г. Способность бактерий окрашиваться (или не окрашиваться) по методу Грама является важным таксономическим свойством, по которому все бактерии делят на 2 группы:

• грамположительные Гр (+),

• грамотрицательные Гр (-).

К грамположительным относят бактерии, в клетках которых комплекс генцианового фиолетового (генцианвиолета) с йодом удерживается при обработке спиртом. Бактерии, не обладающие свойством удерживать данный комплекс и обесцвечивающиеся при обработке спиртом, относят к грамотрицательным. После окрашивания грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный цвет. Различие между этими бактериями заключается в наличии особых веществ в клеточной оболочке микроорганизмов.

Результаты окраски по Граму зависят от возраста культуры: старые и мертвые клетки всегда окрашиваются Гр (-). Хорошим объектом для окраски по Граму служат дрожжи (грамположительны) и кишечная палочка (грамотрицательная).

Фиксированными считают клетки микроорганизмов, в которых прерваны жизненные процессы, но полностью сохранена тонкая структура. Фиксированные окрашенные препараты используют для выявления ряда морфологических особенностей, количественного учета микроорганизмов, а также для проверки чистоты культуры. Их приготовление состоит из этапов:

- приготовление мазка;

- высушивание мазка;

- фиксация мазка;

- окраска мазка.

Окраску по Граму производят на фиксированных препаратах микроорганизмов.

Задание № 1: Опишите культуральные признаки предложенной вам колонии.

Задание № 2: Приготовьте мазок из описанной вами колонии микроорганизмов. Окрасьте его по Граму.

Задание № 3: Зарисуйте увиденные формы микроорганизмов.

Ход работы

Оборудование и материалы: культура микроорганизмов, покровные и предметные стекла, спиртовка, бактериологическая петля, бактериологическая игла, фуксин Пфейфера, генцианвиолет, спирт, раствор Люголя, фильтровальная бумага, кристаллизатор с матрасиком.

1. Приготовление мазка

Препараты готовят на предметных стеклах и накрывают сверху покровными стеклами. Предметные и покровные стекла должны быть чистыми и тщательно обезжиренными. Для удаления жира предметные стекла натирают кусочком мыла (с обеих сторон), после чего вытирают чистой хлопчатобумажной салфеткой. Для проверки чистоты стекла на его поверхность наносят каплю воды. При достаточном обезжиривании капля растекается равномерно и не собирается в выпуклые пузырьки.

Мазок готовят на предметном стекле при помощи бактериальной петли.

Внимание: Все работы с бактериологическим материалом ведут на расстоянии не более 10 см от открытого огня ( в данном случае это пламя горелки), так как только в этой зоне соблюдается стерильность. Невыполнение этого требования приводит к попаданию посторонней микрофлоры на бактериологическую петлю, а также может привести к распространению исследуемой культуры в рабочем помещении, а при работе с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами возможно заражение работающего.

Прежде чем приступить к работе, бактериологическую петлю прокаливают на пламени спиртовки и, не относя от огня более чем на 10 см, остужают либо на воздухе, либо прикасаясь ею к внутренним стенкам пробирки или чашечки Петри с культурой.

Остуженной петлей берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю воды на обезжиренном предметном стекле. Каплю тщательно размазывают петлей по стеклу на площади приблизительно 4 см². Очень важно добиться нужной толщины мазка. Мазок должен чуть опалесцировать и чаще оказывается слишком толстым, чем тонким. Необходимо также, чтобы толщина мазка по всей поверхности была одинаковая. Бактериологическую петлю необходимо снова прокалить во избежание заражения работающего и воздуха помещения исследуемой культурой микроорганизмов.

Затем мазок сушат на воздухе при комнатной температуре или слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется, так как белки коагулируют, искажая структуру и форму клеток. До фиксации препарата следят за соблюдением расстояния от него до пламени спиртовки. Высушенный препарат фиксируют.