81 Использование в вирусологии реакции гемагглютинации (рга).

В основе реакции гемагглютинации лежит способность некоторых вирусов склеивать эритроциты при адсорбции на них. Этой способностью обладают лишь сложно устроенные вирусы, в суперкапсидной оболочке которых имеется белок гемагглютинин (вирусы гриппа, ПГ и другие).

РГА используют:

1. Для обнаружение гемагглютинирующего вируса в исследуемом материале;

2. Для определение гемагглютинирующего титра вируса

Компоненты реакции:

1. Испытуемый ВСМ;

2. 1% взвесь эритроцитов. Выбор эритроцитов зависит от гемагглютинирующих свойств предполагаемого вируса.

Для получения взвеси эритроцитов берут кровь при убое животного или птицы с антикоагулянтом (гепарин, лимонно-кислый натр, жидкость Альсевера. Эритроциты отмывают физраствором с последующим центрифугированием. Надосадочная жидкость должна быть прозрачной. Её удаляют, а из осадка делают 1% взвесь (на 1 кубик эритроцитов берут 100мл физраствора).

Методика постановки РГА.

Капельная РГА. На предметное стекло наносят каплю испытуемого ВСМ и каплю 1% взвеси эритроцитов, перемешивают. При наличии гемагглютинирующего вируса появятся красные хлопья в результате склеивания эритроцитов. Метод ориентировочный.

2 метод. Реакцию ставят на плексиглазовых пластинках с лунками. В 1 ряду 12 лунок, 6 рядов. В ряду лунок готовят ряд последовательных двукратных разведений. Для этого вносят в каждую лунку по 0,5мл физраствора. Затем в первую лунку добавляют 0,5мл ВСМ, из 1й после перемешивния (3хкратного) во вторую, из 2й в 3ю и так далее, из последней в дезраствор. Т.о. получают разведение 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 и т.д. в контрольной лунке смешивают равные объемы физраствора и эритроцитов, а в остальные добавляют по 0,5мл 1% взвеси эритроцитов.

Пластинки слегка встряхивают и оставляют на ровном месте на 35-40 минут.

Учет РГА. Если реакция положительная – на дне лунки образуется осадок в виде перевернутого раскрытого зонтика из склеенных эритроцитов. Значит, в исследуемом материале содержится гемагглютинирующий вирус. При отрицательной реакции и в контроле на дне лунки образуется осадок в виде красной пуговки (склеивания не наблюдается).

Реакцию учитывают в крестах.

+++ - 100% гемагглютинация; ++ - 50% гемагглютинация; + - 25% гемагглютинация; - - реакция отрицательная, 0% гемагглютинация.

Наибольшее разведение ВСМ, вызывающее гемагглютинацию не менее, чем на ++ называется гемагглютинирующим титром вируса и соответствует 1й гемагглютинирующей единице. (ГАЕ).

Если 1 ГАЕ = 1:32, то 4 ГАЕ = 1:8

Вид вируса с помощью РГА не определяют. РГА - не серологическая реакция, так как в ней не участвуют антитела.

82 Реакция торможения гемагглютинации (ртга) и её практическое использование в вирусологии, достоинства и недостатки.

В основе РТГА лежит взаимодействие антител с антигенами, причем антитела (антигемагглютинины) блокируют гемагглютинин вируса, и он утрачивает способность склеивать эритроциты. Эту реакцию используют:

1. Для идентификации вирусов (определяют антиген по заведомо известным антителам)

2. Для прижизненной серологической диагностики (исследуют сыворотку крови на наличие антител по заведомо известному антигену) – у реконвалесцентов, вакцинированных животных определяют таким образом напряженность иммунитета.

Принцип РТГА

В реакции торможения гемагглютинации выделяют 2 фазы:

1. Специфическая. В эту фазу смешивают сыворотку с антигеном. Если в сыворотке содержатся антитела, гомологичные антигену, то образуется комплекс антиген + антитело, и вирус утрачивает гемагглютинирующие свойства;

2. Индикаторная. Роль индикатора выполняет 1% взвесь эритроцтов, при добавлении которой гемагглютинации не наблюдается (если антитела и антиген гомологичны) – положительная реакция (осадок в виде пуговки). При отрицательной реакции, если антиген и антитела гетерологичны, блокировки вируса не происходит, на дне образуется осадок в виде зонтика.

Компоненты реакции

1. Испытуемый вируссодержащий материал или стандартный вирус (диагностикум)

2. Иммунная специфическая сыворотка или испытуемая сыворотка

3. Взвесь эритроцитов

Методика постановки РТГА

РТГА для идентификации вируса

Реакцию ставят на плексиглазовых пластинках с лунками. В ряду лунок готовят ряд последовательных двукратных разведений иммунной специфической сыворотки к предполагаемому вирусу. Для этого разливают по 0,25мл физраствора, а затем в первую вносят 0,25мл сыворотки и переносят в последующие, из последней в дезраствор. Таким образом, получают разведения 1:2, 4, 8, 16 и так далее.

В каждую лунку добавляют по 0,25мл ВСМ в количестве 4 ГАЕ (см. РГА) и выдерживают 20 минут при комнатной температуре или в термостате.

Во все лунки добавляют по 0,5мл 1% взвеси эритроцитов. Выбор эритроцитов такой же, как для РГА,

В контрольных лунках (2х) смешивают сыворотку с эритроцитами и физраствор с эритроцитами (по 0,5 каждого компонента). Выдерживают 20 минут при комнатной температуре и учитывают реакцию.

Если реакция положительная – на дне луно образуется осадок в виде красной пуговки, в контрольных лунках также должны быть пуговки. По антителам сыворотки определяют вид вируса.

РТГА для прижизненной серологической диагностики.

Исследуют сыворотку со стандартным вирусом (4ГА)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Сыворотка по 0,25мл	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	1:1280	1:2560	1:5120
Вирус (4АЕ)	Во все пробирки по 0,25
Через 30 минут
1% взвесь эритроцитов	По 0,5 мл в каждую пробирку
Учет результатов
	0	0	0	0	0	++	++	+++	+++	+++

0 – отсутствие гемагглютинации

+ - наличие гемагглютинации

В данном случае титр антител = 1:160 (наибольшее разведение сыворотки, которое тормозит гемагглютинацию вируса).

Сыворотки перед исследованием инактивируют, т.е. освобождают от ингибиторов. От термолабильных ингибиторов освобождаются путем прогревания сывороток при температуре 56-58 градусов, от термостабильных – с помощью углекислого газа, или используют порошок холерного вибриона.