- •1 Роль ветеринарной вирусологии в подготовке ветеринарного врача. Основные причины преобладания вирусных болезней над инфекционными болезнями животных невирусной этиологии.
- •2 Состояние биологии и медицины конца XIX века. Открытие вирусов. Д.И. Ивановский – основоположник вирусологии.
- •3 Основные этапы в истории вирусологии и превращение вирусологии в одну из фундаментальных биологических наук.
- •4 Вклад отечественных ученых в развитие вирусологии.
- •5 Основные достижения, современное состояние и задачи медицинской и ветеринарной вирусологии.
- •6 Происхождение и природа вирусов.
- •7 Кардинальные свойства вирусов. Физическая структура вирусов.
- •8 Характеристика вирусных нуклеиновых кислот.
- •9 Характеристика вирусных белков.
- •10 Номенклатура вирусов.
- •19 Репродукция вирусов. Схема основных процессов, обеспечивающих реализацию генетической информации.
- •20 Синтез вирусных компонентов.
- •21 Основные типы (формы) взаимодействия вирусов с клеткой. Роль отдельных компонентов вирусной частицы.
- •27 Понятие о гене и геноме. Генотип и фенотип вирусов. Генетические признаки (маркеры) и их использование в характеристике штаммов.
- •28 Мутации и их механизмы. Практическое использование вирусных мутантов.
- •29 Генетические взаимодействия вирусов.
- •30 Негенетические взаимодействия вирусов.
- •11 Пикорнавирусы.
- •16 Реовирусы.
- •12 Тогавирусы и флавивирусы.
- •13 Коронавирусы.
- •14 Рабдовирусы.
- •15 Ретровирусы.
- •17 Парвовирусы.
- •18 Герпесвирусы и поксвирусы.
- •22 Виды культур клеток и их использование. Переживающие и плазменные культуры.
- •23 Первично-трипсинизированные культуры клеток и субкультуры, их использование.
- •24 Перевиваемые и диплоидные культуры клеток, их использование.
- •25 Роллерные и суспензионные культуры клеток, их использование.
- •26 Контаминанты клеточных культур и куриных эмбрионов, методы деконтаминации. Пути создания чистых биологических систем.
- •31 Факторы неспецифической противовирусной защиты животных.
- •32 Противовирусные ингибиторы и их роль в противовирусном иммунитете. Ингибиторы
- •Механизм действия ингибиторов
- •33 Интерферон, его природа, свойства, механизм действия, получение и применение.
- •34 Иммунная система организма и её роль в специфическом противовирусном иммунитете.
- •35 Иммуноглобулины и их роль в противовирусном иммунитете.
- •36 Живые противовирусные вакцины. Принцип получения и контроль живых вакцин. Основные достоинства и недостатки.
- •37 Инактивированные противовирусные вакцины. Принципы получения и контроль инактивированных вакцин. Основные достоинства и недостатки.
- •38 Химические вакцины. Использование методов генной инженерии для получения противовирусных вакцин.
- •39 Препараты для специфической терапии вирусных болезней животных.
- •40 Препараты для неспецифической терапии вирусных болезней. Проблема химиотерапии вирусных болезней животных.
- •41 Вирус ящура. Краткая характеристика заболевания, история открытия и основные свойства вируса.
- •42 Методы лабораторной диагностики ящура. Биопрепараты для специфической профилактики и терапии.
- •43 Вирус бешенства. Краткая характеристика заболевания и основные свойства вируса.
- •44 Методы лабораторной диагностики бешенства. Биопрепараты для специфической профилактики.
- •45 Вирус болезни Ауески. Краткая характеристика заболевания и основные свойства вируса.
- •46 Методы лабораторной диагностики болезни Ауески. Биопрепараты для специфической профилактики и терапии.
- •47 Вирус оспы животных и птиц.
- •48 Вирус диареи крупного рогатого скота.
- •49 Вирус гриппа человека и животных.
- •50 Вирус чумы крупного рогатого скота.
- •51 Вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.
- •52 Вирус парагриппа-3 крупного рогатого скота.
- •53 Современные методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
- •54 Вирус классической чумы свиней.
- •55 Вирус африканской чумы свиней.
- •56 Вирус болезни Тешена.
- •57 Вирус болезни Ньюкасла.
- •58 Вирус гриппа (классической чумы) кур.
- •59 Вирус болезни Марека.
- •60 Правила работы с вируссодержащими материалами. Техника безопасности. Оборудование и аппаратура, необходимые для проведения вирусологических исследований.
- •61 Правила отбора, консервирования и транспортировки вируссодержащего материала от больных животных и трупов.
- •62 Общие принципы и современные методы диагностики вирусных болезней.
- •63 Подготовка патологического материала для вирусологических исследований.
- •64 Индикация вирусов в патологическом материале путем обнаружения вирионов и вирусных телец – включений.
- •65 Использование лабораторных животных в вирусологической практике.
- •66 Отбор яиц для инкубации, условия инкубации, отбор куриных эмбрионов для заражения вирусами.
- •67 Цели и методы заражения куриных эмбрионов.
- •68 Обнаружение вирусов в зараженных куриных эмбрионах.
- •69 Основные солевые, диспегрирующие растворы и питательные среды, необходимые для культивирования клеток, и их компоненты.
- •70 Методика получения первично-трипсинизированной культуры клеток.
- •71 Индикация вирусов в зараженных культурах клеток.
- •72 Методика титрования вирусов по единичному эффекту.
- •73 Определение титра вируса. Методика расчета лд50 по Риду и Менчу.
- •74 Схема устройства и принцип действия люминесцентного микроскопа и люминесцентных осветителей.
- •75 Основные флуорохромы и их использование при диагностике инфекционных заболеваний.
- •76 Принципы изготовления флуоресцирующих сывороток. Виды флуоресцирующих сывороток и их назначение.
- •77 Подготовка препаратов для иммунолюминесцентной диагностики. Прямой метод флуоресцирующих антител (мфа).
- •78 Непрямой метод флуоресцирующих антител (мфа).
- •79 Прямой метод иммуноферментного анализа (ифа).
- •80 Непрямой метод иммуноферментного анализа (ифа).
- •81 Использование в вирусологии реакции гемагглютинации (рга).
- •82 Реакция торможения гемагглютинации (ртга) и её практическое использование в вирусологии, достоинства и недостатки.
- •83 Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (рнга), достоинства и недостатки, практическое использование в вирусологии.
- •84 Реакция диффузной преципитации в агаровом деле (рдп) и её практическое использование в вирусологии.
- •85 Реакция встречного иммуноэлектроосмофареза (рвиэоф). Сущность реакции, применение.
- •86 Генетические методы диагностики вирусных болезней животных (пцр), использование в вирусологии.
- •87 Генетические методы диагностики вирусных болезней животных (днк-зонды), использование в вирусологии.
70 Методика получения первично-трипсинизированной культуры клеток.
Методика получения первичной культуры клеток
Клеточные культуры можно получать из любых тканей, но обязательно, чтобы ткань была живой. Легче всего поучать культуры клеток из эмбриональных тканей, т.к. они обладают большей потенцией к росту. Можно использовать эмбрионы теленка, поросят. Чаще получают из почек эмбриона. Проще всего – из куриного эмбриона.
Получение первичной монослойной культуры из куриного эмбриона.
Берут живой куриный эмбрион в возрасте 10-11 дней. Овоскопируют его, убеждаясь в том, что он живой;
Поверхность скорлупы обрабатывают спиртовым тампоном, йодированным спиртом, фламбируют;
Отрезают скорлупу в области пуги, извлекают эмбрион;
Отрезают голову, лапки, удаляют внутренние органы и оставляют только кожно-мышечный мешок;
Измельчают его ножницами;
Промывают несколько раз в стерильном буферном растворе Хенкса;
Заливают 0,25% раствором трипсина. Поддействием трипсина происходит отделение клеток от кусочков тканей. Для улучшения процесса трипсинизации колбу помещают на магнитную мешалку. Процесс трипсинизации длится 7-10 минут;
Суспензию клеток в трипсине сливают в колбу (емкость), ставят на лед для прекращения действии трипсина;
Кусочки снова заливают свежей порцией трипсина;
Повторяют в зависимости от количества нужных клеток;
Суспензию клеток центрифугируют, чтобы осадить, и сливают трипсин, а осадку из клеток добавляют определенное количество питательной среды. Например, среда 199 – в ней 60 различных компонентов; среда гидролизат лактальбумина;
Ресуспендируют;
Подсчитывают количество клеток в суспензии в камере Горяева, определяют посевную концентрацию (подсчитывают количество клеток в 5ти больших квадратах, разделенных на 16 маленьких, определяют среднее арифметическое в 1м квадрате, умножают на 250 тыс. и получают дозу (например. 10 клеток в квадрате * 250 тыс. = 2500 тыс.), умножают на количество см3(2500 * 5 = 12500), затем делим на посевную дозу (12500/500 = 25), получим количество мл питательной среды, чтобы была нужная концентрация). Посевная доза 500-750 тыс. в 1 см3;
К питательной среде добавляют 10% сыворотки крови. 25мл – 5мл – 2,5мл(сыворотка) = 17,5. Итого к 5 кубикам полученной суспензии добавляют 2,5 мл сыворотки крови (ростовой фактор) и 17,5 мл питательной среды;
Делают посев суспензии на флаконы, пробирки, матрасы;
Помещают на специальную подставку под углом 5 градусов, ставят в термостат
Контроль формирования монослоя
Проводят визуальный и микроскопический контроль. Визуальный – невооруженным глазом.
Если содержимое флакона становится мутным, появляется осадок или пленка – бактериальное загрязнение;
Следят за изменением pH среды. В состав питательных сред вводится индикатор – фенол рот. При посеве культуры значение pH 7,2-7,4. В процессе роста и формирования монослоя pH смещается в кислую сторону, среда желтеет. Если слишком кислой становится – подщелачивают бикарбонатом натрия. Сдвиг в щелочную сторону (малиновая среда) – клеткам плохо, среду нужно подкслить – раствором уксуса.
Микроскопический контроль. Флаконы помещают в лодочки монослоем кверху, находят под малым увеличением микроскопа.
1сут: видны отдельные прикрепившиеся клетки, они начинают расти, удлиняться, получается слой клеток на поверхности стекла – монослой. Он должен быть сплошным. Если поверхность стекла, омываемая питательной средой, на 75% покрыта клетками, можно заражать клетки вирусами