1.2 Титрование путем определения инфекционности для куриных эмбрионов

Количество инфекционного вируса в препарате можно определить по максимальному разведению, вызывающему инфекционный процесс в куриных эмбрионах. Минимальное количество вируса, заражающее 50% эмбрионов, называют единицей инфекционности для эмбрионов. Этот метод наиболее чувствителен и позволяет титровать небольшие количества инфекционного вируса, поскольку для многих штаммов 10 ЕИЭ₅о приблизительно соответствуют 1 БОЕ. По данным электронной микроскопии, 1 ЕИЭ₅₀ соответствует примерно 5—10 вирусным частицам.

Постановка титрования

1. Готовят последовательные 10-кратные разведения исследуемой суспензии вируса на растворе Хэнкса и вводят 0,1 мл каждого разведения в аллантоисную полость нескольких 11-дневных куриных эмбрионов. Количество эмбрионов, используемых для заражения каждым разведением, определяется требуемой точностью титрования, но, как правило, составляет не менее 10. Эмбрионы инкубируют в течение необходимого для размножения вируса времени.

2. Из каждого яйца отбирают аллантоисную жидкость и проводят реакцию гемагглютинации. При этом нет необходимости для каждого образца аллантоисной жидкости готовить последовательные разведения. В этом случае достаточно определить, размножался ли вирус в данном эмбрионе или нет. Для этого 25 мкл исследуемого образца разводят в 0,25 мл физиологического раствора в лунке планшета или в пробирке и добавляют 0,25 мл суспензии эритроцитов.

Расчет титра вируса

Имеется много способов расчета титра вируса в ЕИЭ50. Один из самых удобных методов описан Томпсоном. В примере, приведенном в табл. 1, по 0,1 мл каждого из последовательных 10-кратных разведений вируса вводили в 10 эмбрионов. Для каждого разведения в реакции гемагглютинации определяли количество эмбрионов, в которых размножался вирус, и вычисляли долю, которую они составляли от общего числа зараженных эмбрионов. Для каждого разведения рассчитывали «среднюю удельную инфекционность», представляющую собой среднее арифметическое удельной инфекционности данного и двух соседних разведений. Как правило, «подвижные средние» значения инфекционности образуют монотонно возрастающий ряд. Полученные средние значения используются для расчета дозы вируса со средней удельной инфекционно-стью 0,5. По определению эта доза содержит 1 ЕИЭ50. Точность результатов, полученных этим методом, можно оценить с помощью статистического анализа, описанного Томпсоном.

Таблица 1. Расчет титра вируса)

Разведение	Доза	log	Количество зараженных эмбрионов	«Удельная инфекциои-ность»	«Средняя удельная инфекционное™^
	Y-10-	—11+logY	0/10	0
ю-»	Y.10-	—10+logY	0/10	0	0,33
Ю-	Y-10-	-9 + logY	1/10	0,1	0,266
ю-	Y-10-	-8+logY	7/10	0,7	0,600
ю-	Y-10-	-7 + IogY	10/10	1.0	0,900
Ю-	Y-10-	-6+logY •	10/10	1,0

0,600-0,266 ⁼ 0,334 ⁼ ' я далее

—9+log Y+0,7—8,3+log Y-1 ЕИЭ50. Отсюда logY=8,3; Y-1,9910".