1. Методы титрования вирусов

1.1 Титрование вирусов гриппа в реакции гемагглютинации

Как и многие другие вирусы животных, вирусы гриппа агглютинируют эритроциты. В основе агллютинации лежит взаимодействие гемагглютинина, одного из поверхностных вирусных белков, с рецепторами, расположенными на поверхности эритроцитов. Поскольку каждая вирусная частица содержит не одну молекулу гемагглютинина, образующего шиловидные выступы, при достаточно высокой концентрации вируса формируются крупные агрегаты эритроцитов со структурой типа сети.

Образование таких агрегатов легко наблюдать в лунке или пробирке с U-образным дном; в этом случае нормальные эритроциты образуют компактный осадок на дне пробирки, а агглютинированные оседают равномерно. Эта реакция исключительно удобна для количественного определения вируса.

Для постановки гемагглютинации определенное количество эритроцитов смешивают в лунках планшета с равным объемом исследуемой суспензии вируса в разных разведениях. Планшет затем инкубируют 30—45 мин при комнатной температуре без перемешивания. По результатам реакции можно определить, при каком разведении вирусного препарата утрачивается гемагглютинирующая активность. Количество вируса, агглютинирующее 50% эритроцитов, определяется как 1 гемагглютинирующая единица.

Таким образом, зная, какое разведение вируса соответствует одной ГАЕ, можно вычислить титр вируса в ГАЕ/мл. Значение ГАЕ зависит от условий анализа, в частности от объема реакционной смеси и концентрации эритроцитов; кроме того, постановка реакции в разных лабораториях может иметь свои особенности. Ниже приведена методика, постоянно используемая в лаборатории авторов.

ГАЕ — удобная единица для сравнения разных препаратов вируса, однако она не определяет ни общего количества вируса в препарате, ни количества инфекционных частиц. Тем не менее для любого конкретного штамма вируса соотношение между ГАЕ и другими единицами измерения количества вируса может быть определено эмпирически; затем, если вирус не претерпел генетических изменений, титр в ГАЕ можно использовать для расчета других параметров. Для большинства лабораторных штаммов вируса гриппа выполняется следующее приблизительное соотношение:

1 ГАЕ = 2-10 единиц инфекционности для куриных эмбрионов =2 10 БОЕ = 10 физических единиц.

Подготовка эритроцитов.

В реакции можно использовать эритроциты различного происхождения, например человека или морской свинки, но чаще всего используют куриные эритроциты. 1%-ную суспензию готовят следующим образом.

1. Кровь фильтруют через два слоя муслина.

2. Фильтрат центрифугируют 5 мин в настольной центрифуге при 1500 об/мин.

3. Супернатант и верхний слой осадка, состоящий из лейкоцитов, удаляют с помощью пастеровской пипетки, присоединенной к водоструйному насосу. Клетки 3 раза промывают физиологическим раствором, суспензируя осадок и повторно осаждая эритроциты при 1500 об/мин.

4. Эритроциты ресуспендируют в физиологическом растворе и получают плотный осадок центрифугированием при 2500 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывают, а осадок эритроцитов суспендируют в 100-кратном объеме физиологического раствора. Суспензию тщательно перемешивают и хранят при 4°С.

Постановка реакции.

1. В лунках планшета готовят последовательные двукратные разведения вирусной суспензии с неизвестным титром на физиологическом растворе; объем суспензии в каждой лунке должен быть равен 0,25 мл. В опыт включают также и контрольную лунку с физиологическим раствором.

2. 1%-ную суспензию эритроцитов интенсивно встряхивают и вносят в каждую лунку в количестве 0,25 мл. Смесь в лунках перемешивают, поворачивая планшет, и инкубируют планшет 45 мин без дальнейшего перемешивания на листе белой бумаги.

В предельном разведении, обладающем гемагглютинирующей активностью, наблюдается один из трех типов агглютинации, что можно использовать для приблизительного расчета титра вируса.

Более экономным методом определения титра является микровариант этой реакции, в котором используется по 0,05 мл суспензии вируса и эритроцитов; реакцию можно ставить в микропланшете для титрования. Следует, однако, иметь в виду, что в этом случае одна ГАЕ определяется как количество вируса в объеме 0,05 мл, агглютинирующее 50% эритроцитов в 0,05 мл 1%-ной суспензии.

Факторы, влияющие на результат реакции гемагглютинации.

Результаты реакции гемагглютинации могут искажаться лод действием ряда факторов.

1. Существенно, чтобы перед использованием кровь не хранилась слишком долго. Через 5—7 дней в ней начинается гемолиз, что делает исследование гемагглютинации сначала неточным, а затем вообще невозможным.

2. Поскольку при низкой концентрации эритроцитов получают завышенные значения титра вируса, суспензию эритроцитов перед использованием необходимо тщательно перемешать.

3. Учет результатов реакции не следует откладывать надолго. Помимо гемагглютинина на поверхности вирионов вируса гриппа локализован фермент нейраминидаза, отщепляющий •от олигосахаридов концевые остатки сиаловой кислоты. Поскольку гемагглютинин присоединяется к поверхности эритроцитов именно через остатки сиаловой кислоты, действие нейраминидазы нарушает связи между вирионами и клетками. Поэтому через некоторое время слой агглютинированных эритроцитов начинает разрушаться. Некоторые штаммы вируса гриппа имеют столь высокую нейраминидазную активность, что быстрое удаление клеточных рецепторов препятствует агглютинации при комнатной температуре. В этом случае рекомендуется ставить реакцию гемагглютинации при 4°С.

4. Результат реакции может быть искажен, если используемые планшеты недостаточно хорошо вымыты. Сразу же после окончания работы планшеты следует замочить на 1 ч в 4%-ном растворе NaOH, а затем тщательно промыть дистиллированной водой.

5. Вирусная суспензия может содержать вещества, специфически или неспецифически ингибирующие гемагглютинацию. Эта проблема особенно серьезна при титровании вируса в культуральной жидкости, поскольку входящая в состав питательных сред сыворотка крови содержит подобные ингибиторы. Многие из них могут быть инактивированы прогреванием сыворотки при 56 °С 30 мин; подробнее этот вопрос обсуждается в работе Хойла. В некоторых случаях, однако, возникает противоположная ситуация: некоторые препараты сывороток содержат факторы, вызывающие гемагглютинацию в отсутствие вируса. Поэтому необходимо одновременно с вирусом титровать образец среды от незараженных клеток.

6. Следует помнить, что и вирусы других семейств агглютинируют эритроциты и могут препятствовать проведению специфической реакции. Природу исследуемого вируса можно, разумеется, установить в реакции торможения гемагглютинации с использованием специфической антисыворотки против интересующего исследователя вируса.

Реакция торможения гемагтлютинации.

Способность вируса гриппа связывать и агглютинировать эритроциты можно использовать и для определения концентрации противовирусных антител в образцах сыворотки. Для этого проводят реакцию между последовательными разведениями сыворотки и известным количеством вируса, а затем добавляют суспензию эритроцитов; концентрацию антител определяют, исходя из последнего разведения сыворотки, еще способного тормозить гемагглютинацию.

1. Готовят последовательные двукратные разведения исследуемой сыворотки на физиологическом растворе. В зависимости от того, выполняется анализ в стандартных планшетах или в микропланшетах, объем каждого разведения должен составлять соответственно 0,25 или 0,05 мл.

2. В каждую лунку вносят по 4 ГАЕ стандартного вируса '. Антитела инкубируют с вирусом 30 мин при комнатной температуре.

3. В каждую лунку вносят нужное количество 1%-ной суспензии эритроцитов, перемешивают и продолжают инкубацию еще 30 мин.

4. Учитывают результаты и определяют концентрацию антител, исходя из последнего разведения сыворотки, еще способного тормозить гемагглютинацию.

Примечание. Следует включать в опыт соответствующие контроли, чтобы убедиться в правильности определения концентрации вируса, в том, что сыворотка сама по себе не вызывает гемагглютинации и что в отсутствие вируса эритроциты нормально оседают.