Характеристика вирулентных и умеренных фагов.

При заражении бактерии фагом имеет место так называемая литическая инфекция, т.е инфекция, завершающаяся лизисом клетки хозяина, но это свойственно только так называемым вирулентным фагам, взаимодействие которых с клеткой приводит к гибели клетки и формированию фагового потомства.

При этом различают следующие этапы по взаимодействиям фага с клеткой: смешивание фага с культурой клеток (множественность инфецирования 1 фаг на 10 клеток), причём концентрация должна быть достаточно высокой, с тем чтобы имелась возможность контактирования фагов с клетками. Чтобы не было повторного заражения – после инфицирования в течение 5 минут максимум, когда фаги адсорбируются – разводится эта смесь клеток с фагом с тем чтобы не было повторных заражений при выходе фагового потомства. Выделяется латентный период в течение, которого количество фага не увеличивается, затем очень короткий период выхода, когда резко повышается количество фаговых частиц, когда клетка лизируется и высвобождается фаговое потомство и потом кол-во фагов остаётся на одном уровне, потому что повторного заражения не происходит. На основании этой кривой можно выделить вот эти фазы: вегетативный период «роста» (латентный период), период выхода и рассчитать урожайность фага на 1-у инфицированную клетку. На протяжении латентного периода не удается обнаружить в бактериях ничего похожего на фаговые частицы и не удаётся выделить из таких клеток находящихся в латентном периоде инфекционное начало. Только зрелые фаговые частицы способны вызвать заражение бактерий. Таким образом, вирулентные фаги всегда вызывают гибель бактерий и продуцируют инфекцию, выявляющуюся в продуцировании новых вирусных частиц способных инфицировать следующие и другие чувствительные к ним клетки.

В отличие от вирулентных, заражение умеренными фагам не приводит к лизису бактериальных клеток, а реализуется становление особого состояния сосуществования фага с бактериальной клеткой. Это сосуществование выражается в том, что некое начало фага присутствует в бактериальной клетке без всяких неблагоприятных условий для нее и сохраняется из поколения в поколение. На определенных этапах такого сосуществования фаг активируется в клетке и переходит в состояние литического цикла развития, вызывая лизис клетки и высвобождения фагового потомства. Такие фаги получили название лизогенезирующих или умеренных фагов, а состояние умеренного существования с фагом лизогенией, а бактерии, которые содержат в себе такой скрытый фаг - лизогенных бактерий. Термин лизогенные бактерии происходил из того, что когда-то были обнаружены культуры, у которых спонтанно появлялся фаг, и этот бактериафаг стал рассматриваться как загрязнение культуры, то есть в культуру попадает бактериальный вирус, и такие культуры получили название лизогенных, то есть они генерируют лизис.

20. Три состояния бактериофага. Механизм лизогенизации и индукции профага лямбда.

• Вирион

• Профаг

• Вегетативный фаг

Развитие умеренных фагов (лизогения) подробно охарактеризовано для колифага λ. Это сложный фаг, содержащий линейную двухцепочечную ДНК. На 5/-конце каждой ее цепи имеется одноцепочечная последовательность из 12 нуклеотидов – липкие концы (cos-сайты). Сразу же после проникновения фаговой ДНК в бактериальную клетку, липкие концы ДНК ковалентно соединяются ДНК-лигазой клетки-хозяина и образуется кольцевая молекула.

Далее, как правило, эта кольцевая молекула бактериофаговой ДНК не приступает к транскрипции, а встраивается в бактериальную хромосому. Установлено, что гены фага λ кодируют синтез четырех регуляторных белков, один из которых репрессорный белок сI (кодируется геном сI) блокирует развитие событий литического цикла, а антирепрессорный белок Cro (кодируется геном сro), наоборот, запускает их. После поступления ДНК фага λ в клетку, выбор между литическим и лизогенным путями развития зависит от относительной скорости накопления регуляторных белков: если преобладает антирепрессорная функция белка Cro, то развиваются события литического цикла, если успевает проявиться функция репрессорного белка сI, литический цикл не осуществляется, так как белок сІ связывается с ДНК фага λ в особых участках, препятствуя транскципции фаговых генов.

Встраивание ДНК фага λ в бактериальную хромосому осуществляется согластно интегративной модели А.Кемпбелла. Этот процесс называется сайт-специфической рекомбинацией, так как встраивание ДНК фага λ осуществляется в одном и том же месте (сайте) между генами gal и bio и не зависит от rec A-системы бактериальной клетки.

За интеграцию ДНК фага λ ответственен фермент лямбда-интеграза. Этот фермент узнает две разные последовательности – одну в хромосомной ДНК (att λ), а другую в ДНК фага (b2). Затем происходит разрыв обеих молекул ДНК и последующее их перекрестное воссоединение.

После этого ДНК фага λ реплицируется с клеточной ДНК как единая структура, и все дочерние клетки при делении получают копию фаговой ДНК в составе хромосомы. Подобные клетки называются лизогенными, а ДНК фага λ в них – профагом.

Состояние лизогении поддерживается благодаря постоянному образованию белка-репрессора сІ, и довольно неустойчиво: в любой момент может произойти переключение на литический путь из-за проявления антирепрессорных функций белка Cro. Показано, что в популяции лизогенных бактерий в одной из 102 – 105 клеток происходит спонтанная индукция профага и запускается литический цикл, а такие клетки подвергаются лизису. Эффективность данного процесса зависит как от состояния бактерии-хозяина, так и действия разнообразных физических и химических факторов.

Индукторами перехода лизогения ↔ литический цикл являются ультрафиолетовое излучение, митомицин С, алкилирующие агенты, для некоторых фагов также и изменение температуры.

Явление индукции профага очень важно учитывать при составлении многокомпонентных заквасок для получения молочнокислых продуктов. Если среди штаммов, входящих в такие закваски окажутся лизогенные и нелизогенные, но чувствительные к фагу, обусловившему лизогению бактерий, то произойдет явление фаголизиса (т.е. гибели клеток), очень опасное для молочной промышленности.__ Следует отметить, что фаголизис может быть обусловлен и вирулентными фагами, попадающими в технологические потоки при плохой организации производства. Явление фаголизиса так же может наблюдаться и в процессе микробного синтеза аминокислот, что значительно снижает рентабельность этих отраслей биотехнологии.

Таким образом, умеренные бактериофаги могут находиться в трех состояниях:

- в свободном состоянии в виде частиц – вирионов;

- в состоянии профага;

- в вегетативном (активном) состоянии, когда бактериофаг способен вызывать лизис бактериальной клетки