Задача I 12.

5. Каждое растение требует индивидуальных условий культивирования, позволяющих получать максимальное количество целевого продукта, но есть и общие положения, характерные для большинства видов каллусных растений.

Для успешного культивирования клеток и тканей какой-либо культуры растений необходимо учитывать влияние физических факторов.

Большинство каллусных тканей растут в условиях слабого освещения, так как они не способны к фотосинтезу. Но в то же время свет может являться и фактором морфогенеза, активирующим процессы вторичного синтеза. В качестве источника света используют люминесцентные лампы.

Примером влияния освещенности на метаболизм каллусных клеток является культура чайного растения, у которого под действием света увеличивается биосинтез полифенолов. Однако в культуре клеток Scopolia parviflora тот-же свет подавляет образование алкалоидов.

Для большинства каллусных культур также важна оптимальная температура - около 26 градусов.

Требования к биореакторам:

Они должны быть снабжены системой особого перемешивания (турбинное, восходящим потоком воздуха, встряхиванием), чтобы не разрушить растительные клетки.

Установлено, что максимальный синтез вторичных метаболитов в суспензионной культуре происходит при подаче воздуха снизу.

Оптимальная влажность для роста культуры обычно составляет 60-70%.

Весьма существенным для обеспечения синтеза продуктов вторичного метаболизма является подбор ингредиентов среды культивирования.

Для культивирования изолированных клеток и тканей больше подходят жидкие питательные среды, в которые обязательно должны быть включены:

• неорганические питательные вещества - макроэлементы, микроэлементы:

• источники железа; органические добавки - витамины, фитогормоны, ауксины (индолилуксусная кислота, нафтилуксусная кислота и 2.4- дихлорфеноксиуксусная кислота)

• цитокины (6-бензиламинопурин. N-изоптен. 6-фурфуриламинопурин) - регуляторы роста растений, играющие роль пусковых механизмов; источники у глеводов - сахароза и глюкоза.

Ауксины вызывают дедифференцировку клеток экспланга и повышают продуктивность культур клеток, являясь пусковыми механизмами продуктов первичного и вторичного метаболизма.

Индуцируя клеточное ^(ёлёгшё.'Тш^оЧсйны по-разному влияют на' накопление^ вторичных метаболитов: одни не реагируют на внесение в сред) цитокинина. например культура клеток Datura tatula, другие, например. Scopolia maxima, активно образуют алкалоиды.

Высокое содержание нитратов, ионов аммония, калия, фосфора также стимулирует выработку вторичных метаболитов.

Для синтеза вторичных метаболитов весьма существенно внесение в питательную среду предшественников, стимулирующих определенные ферментативные пути метаболизма. Например, внесение фенилаланина в среду для культивирования клеток увеличивает выход диосгенина на 100%.

Задача 120.

6. Этапы создания искусственных антигенов:

1. Накопление биомассы микроорганизмов;

2. Выделение высокоочищенного антигена белковой или полисахаридной природы;

3. Анализ первичной структуры молекулы антигена;

4. Разработка способа искусственного синтеза данной антигенной молекулы или фрагмента, который отвечает за антигенность;

Искусственные антигены применяются в комплексе с адъювантами. Примером такой вакцины может служить вакцина против малярии, разработанная в Колумбии.

Использование искусственных антигенов позволяет создавать ассоциированные (поливалентные) вакцины, применение которых дает возможность уменьшить число иммунизаций. Примером поливалентных вакцин служит вакцина возбудителя пневмонии (содержит 6 или 12 типов возбудителя).

Генноинженерные вакцины.

Это препараты, полученные с использованием рекомбинантных клеток. К ним относятся все современные противовирусные вакцины, например против вируса гепатита В.

Стадии конструирования таких вакцин:

1. Выделение или получение гена, кодирующего протективный антиген:

2. Внесение гена в экспрессирующийся вектор (плазмиду. вирус или фаг):

3. Введение векторы в клетку;

4. Клонирование вектора и отбор клонов, продуцирующих протективный антиген;

5. Испытание иммуногенной активности антигена:

6. Культивирование клеток и выделение протективного антигена;

7. Проверка иммуногенной активности.

Рибосомальпые вакцины.

Такие вакцины состоят из рибосом микробов-возбудителей.

Этапы получения:

1. 11акопление биомассы клеток микроорганизма;

2. Разрушение бактериальных клеток механическим способом или с помощью ультразвука;

3. Выделение рибосом методом ультрацентрифугирования;

4. Проверка иммунологической активности;

В клинической практкё применяется «Рибомуннил» - nperrlpaf xdSiSpaWP рибосомы возбудителей пневмонии, а в качестве адъюванта используется пептидогликан Klebsiella pneumoniae.

ДНК-вакцин ы.

1. Выделение или получение необходимого участка вирусной ДНК:

2. Внесение участка вирусной ДНК в плазмиду:

3. Введение плазмид в мышцу животного;

4. Синтез организмом животного белка вируса, а затем и клеток-киллеров, направленных против клеток с белками вируса на клеточной мембране. В результате этого происходит вакцинация организма от вирусной инфекции (метод «генной» вакцинации);

5. Выделение и проверка иммунологической активности;

Антиидиотипические вакцины.

Это препараты на основе идиотипипических антител. Находятся в стадии разработки. Эти вакцины являются вакцинами без антигенов.

Таким образом, для получения вакцин используют разные подходы:

Патогенный микроорганизм модифицируют, делетируя (убирая) гены, ответственные за вирулентность, при этом сохраняется способность штамма вызывать имуииый ответ. Получаются живые вакцины, содержащие непатогенные микроорганизмы, которые не могут ревертировать и становиться патогенными.

Гены или их сегменты, кодирующие основные антигенные детерминанты (белки) патогенных микроорганизмов, экспреесируют в альтернативном хозяине, например кишечной палочке, получают нужный продукт в большом количестве и используют его как вакцину. Такие вакцины, которые содержат лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма, называют субъединичными вакцинами.

Клонированные гены, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенного микроорганизма, встраивают в геном непатогенного носителя (обычно вируса) и получают живую безопасную, не содержащую болезнетворных микроорганизмов вакцину.

В качестве продуцентов генов используют бактериальные клетки, содержащие рекомбинантные плазмиды с соответствующими генами. После получения достаточной биомассы (количества копий) плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и примесей. Полученную ДНК-вакцину вводят парентерально, при этом большая ее часть поступает в межклеточное пространство, после чего включается в клетки.