97. Дериватизация
Среди существующих методических подходов к определению гистамина и биогенных аминов можно назвать:
- полимерный, разработанный специалистами из университета Южной Каролины и основанный на использовании полимера, меняющего цвет в присутствии биогенных аминов [7];
- радиоизотопный, флюорометрический, иммуноферментный, колоримет-рический, газовой и масс-спектрометрии.
В настоящее время наиболее широко используемым методом является метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, что соответствует требо-ваниям регламента комиссии ЕС 2073/2005. Метод основан на экстракции биогенных аминов вместе с аминокислотами, растворами органических кислот из субстрата, с последующим применением полученного экстракта для хрома-тографического определения. Поскольку детектирование биогенных аминов как таковых затруднено, в данном методе используется пред- или постколоночная дериватизация – получение производных анализируемого вещества, обладающих иными аналитическими свойствами (например, иным УФ-спектром, флуоресцен-цией, термической стабильностью, летучестью и пр.).
В частности, в лаборатории Испытательного Центра ФГУП АтлантНИРО иcпользуется методика определения массовых долей гистамина, кадаверина, путресцина, тирамина, спермина и спермидина с применением высокоэффек-тивной жидкостной хроматографии.
Нами были проведены работы по выбору наиболее оптимальных условий выделения биогенных аминов из рыбного сырья и рыбопродукции и условий их разделения. Были установлены параметры сходимости и воспроизводимости и разработан проект ГОСТ Р 53149-2008 «Продукты пищевые. Рыба, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Количественное определение содержания биогенных аминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» [8].
Сущность метода заключается в экстракции разбавленным раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) биогенных аминов из гомогенизированной пробы, очистке экстракта на ионообменной смоле Amberlite-CG50, предколоночной дериватизации аминов для получения интенсивно флуресцирующих производных (получение производных аминов с 5-диметиламино-нафталинсульфонил хлоридом (дансил-хлоридом или ДНС-хлоридом)) с последующим количественным определением выделенных аминов высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Предел обнаружения массовых долей аминов в анализируемых продуктах 0,1 мг/кг.
В зависимости от задачи, аминокислотные анализаторы поддерживают как классический метод анализа аминокислот на основе постколоночной дериватизации реакцией с нингидрином, так и высокочувствительные методы предколоночной дериватизации с ортофталевым альдегидом (OPA) и 9-флуоренилметилхлороформиатом (FMOC). Для каждого варианта аминокислотного анализа помимо оборудования предлагается аналитический комплект, включающий колонку, предколонку и набор необходимых реактивов.
1. Классический анализ методом постколоночной дериватизации заключается в разделении аминокислот на ионообменной колонке при ступенчатом градиенте pH и последующей реакции с нингидрином в реакторе системы Pinnacle PCX. Обнаружение окрашенных производных аминокислот проводится при помощи спектрофотометрического детектора на длинах волн 570 и 440 нм. Этот метод получил широкое распространение для анализа пищевых продуктов и кормов, а также в клинических и генетических исследованиях.
2. Анализ аминокислот методом предколоночной дериватизации с флуоресцентными маркерами (OPA, FMOC и др.) обладает более высокой чувствительности по сравнению с классическим методом. Аминокислоты обрабатываются орто-фталевым альдегидом, ОРА (в реакторе системы Pinnacle PCX или автосамплере), разделяются на обращенно-фазной колонке в режиме бинарного градиента. Для регистрации аминокислот используется флуоресцентный детектор, количественный анализ проводится при длине волны на канале возбуждения 330 нм и на канале регистрации 450 нм. Гидролизаты белков анализируются так же хорошо, как и физиологические жидкости. Метод позволяет обнаруживать следовые количества аминокислот и, потому, нашел широкое применение в медицине.
Метод с преколоночной дериватизацией основывается на обращенно-фазной хроматографии. Сначала получают производные аминокислот. Производные малополярны и благодаря поглощению в УФ-обпасти спектра их можно детектировать фотометрически. Используются обращенно-фазные колонки и градиентное элюирование с возрастающей концентрацией ацетонитрила.
98. Физико-химический метод разделения жидких или газообразных смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна; Хроматография широко применяется для анализа биологических макромолекул, имеется ряд методов - тонкослойная Хроматография, Хроматография на бумаге, ионобменная Хроматография, адсорбционная Хроматография и др.
99.
