Как устроены приборы для Real-time пцр?
Источник света, в идеале – несколько, с разными длинами волн, или источник с широким диапазоном и фильтром или диф решеткой
Оптическая система, которая посылает свет в образцы, свет накачки?
Оптическая система, которая посылает свет на детекторы
По пути свет тоже проходит сквозь фильтры
Можем регистрировать несколько красителей
Более современный прибор
Вся оптическая система собрана на маленькой тарелочке, и она по-очереди обходит все образцы, быстро очень
Снимается проблема калибровки между ячейками – надо откалибровать в 1 ячейке.
С точностью до расстояния параметры сохраняются
Источник света и детекторы твердотельные
Детектор – фотодиод или маленькая СД-камера.
Биорад,
Красители
Неспецифические (интеркалирующие) красители
+: Недорого , универсально – можно регистрировать любые матрицы, не зная состава
- : Неспецифичность детекции (любая дцДНК)
Специфические (метка связана с олигонуклеотидом) гибридизационые зонды
+ : спецефичность детекции, мультиплексная детекция (несколько меток), если они отличаются каналами детекции количественная оценка, определение точечных мутаций
-: надо знать состав матрицы
Неспецифический – Сайбр-грин. SYBR Green I
флюоресциирует в 200 раз ярче если связан с двойной спиралью ДНК
У него очень большой коэффициент разгорания – сотни раз
Фон практически отсутствует
Внутримолекулярный перенос
Регистрация в конце элонгации.
Минус – сильно изменяет условия ПЦР. Изменяет специфичность фермента. Подбор условий необходимо проводить в присутствии красителя.
А вот бромистый этидий светится и в растворе.
Специфичные зонды
Главное преимущество – мультиплексный анализ .5 и 6 каналов. Дешевй БиоРад – 6 каналов.
Исторически – 2 технологии, Такман (запатентованная, в России делается подпольно), Бикон.
Технология TaqManTM
Набор для ПЦР
Есть специфический контекст
Есть комплементарный контексту зонд, к которому ковалентно присоединен флюорофор и тушитель.
Если тушитель находится в непосредственной близости от флюорофора, то энергия возбуждения с высокой вероятностью переходит на него. Сцинтиллятор вспомнили.
(Если энергия возбуждения ниже , то вероятность высока).
Сам тушитель светиться не может – так сконструирован. «черный тушитель».
Зонд должен образовывать дуплексы с еще большей эффективностью, чем праймеры. Подбор этих зондов – отдельная научная задача.
На этапе элонгации полимераза, с экзонуклеазной активностью, когда доходи до зонда, разрушает его, и разобщает флюорофор и тушитель. Флюорофор высвобождается и светится.
На какой стадии лучше детектировать? Вообще можно на любой, но на элонгации не рекомендуется, т.к. зонды гидролизуется, концентрация изменяется. В общем, на любой, при условии, что все зонды гидролизованы.
Лучше на денатурации. Потому что красители все равно уходят в среду – первое преимущество Такмана.
Второе – усиление сигнала. А нам это важно, т.к. мы должны регистрировать малые концентрации с высокой точностью.
Делов том, что усиление флюоресценции происходит быстрее, чем увеличение концентрации продукта. Непропорционаьно. На каждом шаге мы видим сумму предыдущих шагов, и еще добавляем этот.
Если в начале реакции содержится x копий мишени, TaqMan высвобождает в первом цикле x флюоресциирующих меток.
Во втором цикле общее кол-во свободных меток в растворе 3x
В третьем цикле общее кол-во свободных меток в растворе 7x
В 25-м цикле общее кол-во свободных меток в растворе 33,554,431x
Минус – нужен очень эффективный тушитель. Им определяется порог шума и чувствительность метода
Сделать такие тушители достаточно непросто
Хотя этот минус будет у Бикона тоже
Проблема, что производство лицензировано
некоторых случаях гаситель способен флюоресцировать.
Дополнительные усилия по фильтрации
Спектр флюоресценции репортера должен отличаться от спектра флюоресценции гасителя
Ограничение на выбор меток (мультиплексный анализ)
Производство лицензировано, спектр зондов от производителя недостаточно широкий
Все более-менее используемые гены уже имеют свой зонд.
Beaсon
Кроме области, которая будет детектировать специфичный контекст, у нас есть область, образующая шпильку, и в растворе при низкой температуре флюорофор и тушитель находятся очень близко в пространстве – флюоресценции нет. Чтобы произошла флюоресценция, должна присутствовать оц матрица и должна произойти гибридизация. Этот участок длиннее, и его термодинамика лучше – гибридизация произошла и зонд в таком состоянии и останется. Фермент гидролизовать зонд не может, может только снять
Более сложная штука
Детектировать можно перед элонгации – нужно делать специальную фазу детекции зонда. И надо использовать не одну температуру, а профиль и постепенно понижать температуру, так чтобы дать зонду не только связаться с матрицей, но и дать свободному зонду образовать шпильку.
Как определить, не является ли это такманом? Можно посмотреть цифры, у Такмана растет не qn, а быстрее.
Плюс – более высокая специфичность. И можно использовать более эффективные гасители. И вообще разнообразие меток больше. Меньше ограничений, короче.
Минус – трудно исключить гидролиз зонда. Какбы мы не ухитрялись, фермент все равно покусает. Или взять фермент, вообще не обладающий экзонуклеазной активностью и способностью вытеснять. Но тогда будут искажаться результаты ПЦР – не будут мультиплицироваться районы, где гибридизован зонд.
Трудно еще подобрать состав зонда. Температура плавления шпильки и адресной части должны сильно различаться.
Если бикон отжигается на матрице, флюоресценция увеличивается.
На практике предсказать температуру плавления beacon сложно: концевая последовательность 10 - 15 пар. Любое изменение резко меняет свойства